Caratterizzazione preliminare della regione promotrice del gene Pp-endoPG in genotipi di pesco Non Melting, Melting e Slow Melting

L’etilene svolge un ruolo fondamentale nel processo di maturazione del frutto climaterico di pesco (Prunus persica) influenzandone lo sviluppo delle caratteristiche organolettiche e le modificazioni a carico della tessitura della polpa. L’espressione di molti geni coinvolti nel softening e nel melting, come in particolare la endopoligalatturonasi (Pp-endoPG), è controllata dall’etilene. In pesca tuttavia le diversità di tessitura dei frutti delle varie cultivar non appaiono legate ai livelli assoluti di etilene prodotto o emesso a maturità. Infatti i frutti di genotipi Non Melting (NM), caratterizzati da elevata consistenza e ridotta o nulla espressione di Pp-endoPG, evolvono più etilene di quelli Melting (M), che presentano elevata espressione di Pp-endoPG con accumulo di una forma attiva dell’enzima. Ciò suggerisce una diversa regolazione del processo di ammorbidimento probabilmente legata ad una differente sensibilità di percezione del segnale ormonale. Altri genotipi, come ‘Big Top’, hanno frutti che accumulano una endoPG attiva ed emettono etilene lentamente in fase di post-raccolta. A maturità questi frutti, definiti Slow Melting, presentano un’elevata consistenza della polpa e vengono facilmente confusi con quelli dei genotipi Stony Hard, caratterizzati da scarsa o nulla produzione di etilene ed in grado di rammollire solo in risposta a somministrazioni esogene dell’ormone. Precedenti analisi molecolari condotte da questo gruppo di ricerca hanno evidenziato nei diversi genotipi di pesca la presenza di varianti geniche di Pp-endoPG (m, M, Bt, Sh) con caratteristici polimorfismi di sequenza (SNPs e delezioni introniche), ma ORF sostanzialmente simili. Nel presente studio, condotto su genotipi di riferimento (quali NM ‘Oro A’, M ‘Bolero’ e Slow Melting ‘Big Top’), sono state isolate e analizzate le regioni promotrici delle diverse varianti di Pp-endoPG allo scopo di individuare motivi regolativi, eventualmente correlabili alla diversa espressione del gene in risposta all’etilene, e differenze di sequenza possibilmente utilizzabili come marcatori molecolari per la selezione assistita di nuovi genotipi. Mediante screening di librerie genomiche con tecnica Genome Walking, è stato possibile isolare le regioni 5’-UTR dei cloni m di ‘Oro A’ (m-O: -1970 bp) e ‘Bolero’ (m-B: -1712 bp) e del clone Bt di ‘Big Top’ (-1663 bp). In ‘Bolero’, eterozigote al locus endoPG, dai prodotti di amplificazione ottenuti mediante Genome Walking è stato possibile isolare, discriminandolo da m-B, il clone M (-1712 bp) con tecnica PAMSA (PCR Amplification of Multiple Specific Alleles) e l’uso di un set di primer appropriati. Le sequenze promotrici dei cloni m e Bt sono risultate molto simili fra loro (salvo alcuni polimorfismi), mentre quella del clone M è risultata molto diversa, condividendo con m e Bt solo una regione di 500 bp a ridosso del codone di inizio. L’analisi PLACE ha permesso di individuare molti elementi regolatori putativi legati alla risposta ormonale (ABA), alla luce e agli stress (biotici e abiotici). Di interesse è risultata la presenza di un microsatellite (GAn) di lunghezza diversa nei diversi cloni, utilizzabile come marcatore, e di un Ethylene Responsive Element (ERE). In particolare, il motivo ERE individuato nelle sequenze promotrici dei cloni Pp-endoPG m-B, M e Bt risulta assente nel clone m-O suggerendo una possibile relazione con la ridotta espressione di Pp-endoPG nel genotipo NM ‘Oro A’ a fronte di una sua maggiore produzione di etilene. I risultati sono stati successivamente analizzati anche in relazione alla sequenza del genoma.