CLINICAL AND MOLECULAR BIO-MARKERS IN SKULL BASE CHORDOMAS

Introduction. Skull base chordomas are rare slow-growing neoplasms that arise from notochord. Their morbidity is mainly related to highly aggressive local invasion and resistance to treatments. Due to its heterogeneous appearance and not fully understood clinical and molecular behaviors, the main goal of the present work is to identify clinical and bio-molecular markers as specific prognostic factors that could be used for the management of skull base chordoma patients. Achieving a detailed prognostic signature of skull base chordomas is of paramount importance to personalize the treatment to each specific patient. Moreover, sphingolipids analysis is emerging as a new approach in many cancers and it has never been applied in chordomas. Our aim is to investigate chordoma biological behavior and the role of ceramides production in this context of proliferation and invasion. Patients and Methods. A retrospective review of all the patients diagnosed and treated for a skull base chordoma at the Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta” between January 1992 and December 2017 has been performed. Clinical, radiological, surgical and pathological data have been collected. A prospective collection of frozen surgical specimens has been performed to analyze ceramides species in chordomas. Sphingolipids were extracted from frozen tissues and total ceramides and dihydroceramides were evaluated by liquid chromatography and mass spectrometry. Survival analysis was performed according to Kaplan-Meier method. Univariate comparisons were conducted using Mann-Whitney, Chi-square and exact Fisher test. Simple linear regression and correlation with computation of Pearson coefficients analyses were conducted. Using a logistic regression model, statistically significant predictors were rated based on their odds ratios in order to build a personalized grading scale – the Peri-Operative Chordoma Scale (POCS). Results. Eighty-seven consecutive patients were surgically treated for a skull base chordoma during the period of recruitment. Seventy-eight patients were eligible for the retrospective review. There were 38 males (48.7%) and 40 females (51.3%). The mean follow-up was 69 months (range, 3–233). One-hundred-fourteen surgical operations were performed in the initial recruitment or recurrent setting. The presence of motor deficits in skull base chordoma revealed to be a significant prognostic factor correlating with a worse PFS (p=0.0480). Calcification on KM analysis showed a correlation with better outcomes (OS) compared with tumor lacking any calcification on CT scan (p value=0.0402). The degree of MR contrast enhancement revealed to be a significant and strong prognostic factor in terms of OS and PFS (p≤0.0001 and 0.0010, respectively). Jugular foramen involvement represented a significant prognostic factor with a worse PFS in the cohort of primary skull base chordomas (p=0.0130). The presence of chordoma in the pre-brainstem cistern revealed to be a significant prognostic factor with a worse PFS in the cohort of recurrent skull base chordomas (p=0.0210). Brainstem dislocation represented a significant prognostic factor correlating with a both worse outcome in terms of OS and PFS in the cohort of recurrent skull base chordomas (p=0.0060 and 0.0030). Extent of resection represents a strong prognostic factor according to PFS in the cohort of primary skull base chordomas (p=0.0200). Patients operated by an experienced chordoma surgeon did better in terms of prolonged PFS in the cohort of primary patients (p=0.0340). Development of post-operative complications in primary skull base chordoma patients represented an important prognostic factor related to both OS and PFS (p≤0.0001 and 0.0360, respectively). In the cohort of recurrent chordomas, ∆KPS correlated to both OS and PFS (p=0.0010 and 0.0180, respectively). Moreover, post-operative radiation treatment correlated with prolonged OS (p=0.0020) and PFS (p=0.0100). The following factors were found to be statistically significant predictors of both PFS and OS in the logistic regression model: MR contrast enhancement (intense vs mild/no), preoperative motor deficit (yes vs no) and the development of any post-operative complications (yes vs no). A grading scale was obtained with scores ranging between 0 and 17 (Nagelkerke’s pseudo R2=0.656). The mean total ceramides and dihydroceramides species in primary chordomas were 808.4±451.4 pmol/mg (522.5-1760.2) and 30.7±16.4 pmol/mg (17.6-62.4), respectively. The mean total ceramides and dihydroceramides species in recurrent chordomas were 1488.1±763.8 pmol/mg (540.7-2787.5) and 67.2±45.5 pmol/mg (9.0-145.6), respectively. Total ceramides species were significantly higher in recurrent chordomas that underwent previous surgical resection and radiation therapy in comparison to the primary chordomas (p=0.0496). The mean total ceramides and dihydroceramides species in “intense enhancement” group were 1597.6±737.8 pmol/mg (592.7-2787.5) and 69.1±45.0 pmol/mg (17.8-145.6), respectively. The mean total ceramides and dihydroceramides species in “no or mild enhancement” group were 664.7±120.4 pmol/mg (522.5-826.0) and 31.5±13.6 pmol/mg (17.6-53.6), respectively. Total ceramides and dihydroceramides were significantly higher in “intense enhancement” chordomas in comparison to the “no/mild enhancement” chordomas (p=0.0290 and p=0.0186, respectively). Analyzing the association between ceramides level and MIB-1 within each skull base chordoma patient, total ceramides level showed a strong association (r=0.7257, r2=0.5267) with MIB-1 staining (p=0.0033). Analyzing the association between DHCer level and MIB-1 within each skull base chordoma patient, total DHCer level showed also strong association (r=0.6733, r2= 0.4533) with MIB-1 staining (p= 0.0083). Among the single ceramides species Cer C24:1 (r=0.8814, r2=0.7769, p≤0.0001), DHCer C24:1 (r=0.8429, r2=0.7104, p=0.0002) and DHCer C18:0 (r=0.9426, r2=0.8885, p≤0.0001) levels showed a significant correlation with MIB-1 staining. Final candidate predictive factors that well fitted the regression model were: cer24:1 (r=0.824, p≤0.001), and DHCer C18:0 (r=0.748, p=0.002). Conclusion. Our clinical analysis showed that pre-operative clinical symptoms (motor and cranial nerve deficits), anatomical location (jugular foramen, pre-brainstem cisterns and brainstem dislocation), surgical features (extent of tumor resection and surgeon’s experience), development of post-operative complications and KPS decline represent significant prognostic factors. The degree of MR contrast enhancement significantly correlated to both OS and PFS. We also preliminarily developed the Peri-Operative Chordoma Scale (POCS) to aid the practitioner in the personalized management of patients undergoing potential adjuvant therapies. Our lipid analysis showed ceramides as promising tumoral bio-markers in skull base chordomas. Long and very long chain ceramides, such as Cer C24:1 and DHCer C24:1, may be related to a prolonged tumor survival, aggressiveness and the understanding of their effective biological role will hopefully shed lights on the mechanisms of chordoma radio-resistance, tendency to recur and use of agents targeting ceramide metabolism. Such results should be validated in future larger clinical, in-vitro and in-vivo studies to confirm such intricate link between ceramides and chordoma aggressive behavior.

Introduzione. I cordomi della base cranica sono tumori rari e a lenta crescita derivanti dalla notocorda. La loro morbilità è principalmente legata alla loro invasione locale e alla resistenza ai trattamenti. A causa del loro aspetto eterogeneo e del loro comportamento clinico-molecolare non completamente compreso, l'obiettivo principale del presente lavoro è quello di identificare marcatori clinici e bio-molecolari come fattori prognostici specifici che potrebbero essere utilizzati per la corretta gestione di tali pazienti. Il raggiungimento di una firma prognostica dettagliata dei cordomi del basicranio è di fondamentale importanza per poter personalizzare il trattamento di ciascun paziente. Inoltre, l'analisi degli sfingolipidi sta emergendo come un nuovo approccio in molti tumori e non è mai stata applicata nei cordomi. L’obiettivo principale è lo studio del comportamento biologico del cordoma e il ruolo della produzione di ceramidi in questo contesto di proliferazione e invasione locale. Pazienti e Metodi. È stata eseguita una revisione retrospettiva di tutti i pazienti diagnosticati e trattati per cordoma della base cranica presso la Fondazione IRCCS Istituto Neurologico "Carlo Besta" tra il gennaio 1992 ed il dicembre 2017. Sono stati raccolti dati clinici, radiologici, chirurgici e patologici. È stata eseguita una raccolta prospettica di campioni chirurgici congelati per analizzare le specie di ceramidi. Gli sfingolipidi sono stati estratti dai tessuti congelati; i ceramidi e i diidroceramidi sono stati valutati mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. L'analisi di sopravvivenza è stata eseguita secondo il metodo di Kaplan-Meier. I confronti univariati sono stati condotti usando i test di Mann-Whitney, Chi-square e il test esatto di Fisher. Sono state condotte analisi di regressione e correlazione lineari. Utilizzando un modello di regressione logistica, i predittori statisticamente significativi sono stati pesati sulla base dei loro odds ratio al fine di sviluppare una scala personalizzata - la Peri-Operative Chordoma Scale (POCS). Risultati. Ottantasette pazienti sono stati trattati chirurgicamente per cordoma del basicranio. Settantotto pazienti sono stati dichiarati eleggibili per la revisione. I pazienti erano 38 maschi (48.7%) e 40 femmine (51.3%). Il follow-up medio era di 69 mesi (intervallo, 3-233). Sono stati eseguiti centoquattordici interventi chirurgici. La presenza di deficit motori si è rivelata essere un fattore prognostico significativo correlato a una PFS peggiore (p=0.0480). La presenza di calcificazioni ha mostrato una correlazione con risultati migliori di OS rispetto al tumore privo di calcificazioni (p=0.0420). Il grado di impregnazione contrastografica alla RM si è rivelato essere un fattore prognostico significativo in termini sia di OS che di PFS (p≤0.0001 e 0.0010, rispettivamente). Il coinvolgimento del forame giugulare e delle cisterne anteriori al tronco encefalico si sono rivelati due fattori prognostici significativi correlati con una riduzione di PFS (p=0.0130 e p=0.0210, rispettivamente). La dislocazione del tronco cerebrale rappresentava un fattore prognostico significativo correlato a peggiore OS e PFS nella coorte di cordomi recidivi (p=0.0060 e 0.0030, rispettivamente). L'estensione della resezione tumorale rappresentava un forte fattore prognostico secondo la PFS nella coorte di cordomi primari (p=0.0200). I pazienti operati da un chirurgo esperto (definito come il chirurgo che ha eseguito più di 10 procedure chirurgiche per cordoma del basicranio nella presente serie) hanno avuto un outcome migliore in termini di PFS nella coorte di pazienti primari (p=0.0340). Lo sviluppo di complicanze post-operatorie in pazienti con cordoma primario rappresentava un importante fattore prognostico correlato sia ad OS che a PFS (p≤0.0001 e 0.0360, rispettivamente). Nella coorte di cordomi recidivi, ∆KPS correlava sia a OS che a PFS (p=0.0010 e 0.0180, rispettivamente). Inoltre, il trattamento radioterapico postoperatorio correlava ad un aumento di OS e PFS (p=0.0020 e p=0.0100, rispettivamente). I seguenti fattori si sono rivelati predittori statisticamente significativi sia di PFS che di OS nel modello di regressione logistica: il grado di impregnazione contrastografica alla RM (intenso o lieve/nessuno), la presenza di deficit motori preoperatori (si o no) e lo sviluppo di complicanze post-operatorie (si o no). Una scala è stata sviluppata con score compresi tra 0 e 17 (Nagelkerke’s pseudo R2=0.656). Le specie totali di ceramidi e diidroceramidi nei cordomi primari erano 808.4±451.4 pmol/mg di proteine (522.5-1760.2) e 30.7±16.4 pmol/mg (17.6-62.4), rispettivamente. Le specie totali di ceramidi e diidroceramidi nei cordomi recidivi erano 1488.1±763.8 pmol/mg (540.7-2787.5) e 67.2±45.5 pmol/mg (9.0-145.6), rispettivamente. Le specie totali di ceramidi erano significativamente più elevate nei cordomi recidivi sottoposti a precedente resezione chirurgica e radioterapia rispetto ai cordomi primari (p=0.0496). Le specie totali di ceramidi e diidroceramidi nel gruppo "intensa impregnazione contrastografica" erano 1597.6±737.8 pmol/mg (592.7-2787.5) e 69.1±45.0 pmol/mg (17.8-145.6), rispettivamente. Le specie totali di ceramidi e diidroceramidi nel gruppo "nessuna o lieve impregnazione contrastografica" erano 664.7±120.4 pmol/mg (522.5-826.0) e 31.5±13.6 pmol/mg (17.6-53.6), rispettivamente. Ceramidi e diidroceramidi totali erano significativamente più alti nei cordomi ad “intensa impregnazione contrastografica” rispetto ai cordomi "nessun o lieve impregnazione contrastografica" (p=0.0290 e p=0.0186, rispettivamente). Analizzando l'associazione tra livelli di ceramidi e MIB-1 all'interno di ciascun paziente con cordoma della base cranica, i livelli di ceramidi totali hanno mostrato un'associazione forte (r=0.7257, r2=0.5267) con la colorazione MIB-1 (p=0.0033). Analizzando l'associazione tra i livelli di diidroceramidi e MIB-1 all'interno di ciascun paziente con cordoma della base cranica, i livelli totali di diidroceramidi hanno mostrato anche un'associazione forte (r=0.6733, r2=0.4533) con MIB-1 (p=0.0083). Tra le singole specie di ceramidi, Cer C24: 1 (r=0.8814, r2=0.7769, p≤0.0001), DHCer C24: 1 (r=0.8429, r2=0.7104, p=0.0002) e DHCer C18:0 (r=0.9426, r2=0.8885, p≤0.0001) hanno mostrato una correlazione significativa con il MIB-1. Conclusioni. L’analisi clinica ha dimostrato che la sintomatologia preoperatoria (deficit motori e a carico dei nervi cranici), la posizione anatomica (forame giugulare, dislocazione del tronco encefalico), le caratteristiche chirurgiche (estensione della resezione tumorale ed esperienza del chirurgo operatore), la presenza di complicanze postoperatorie e il declino del KPS si sono rivelati fattori prognostici significativi. Inoltre, il grado d’impregnazione contrastografica alla RM è stato significativamente correlato sia a OS che a PFS. È stata sviluppata in via preliminare la Peri-Operative Chordoma Scale (POCS) per aiutare il clinico nella gestione personalizzata del paziente che si sottoporrà a potenziali terapie adiuvanti. L’analisi di sfingolipidi, invece, ha evidenziato come i ceramidi possano rappresentare un promettente bio-marcatore nei cordomi. In particolare, i ceramidi a catena lunga e molto lunga, come Cer C24:1 e DHCer C18:0, possono concorrere ad una prolungata sopravvivenza del tumore, aggressività e l’effettiva comprensione del loro ruolo biologico potrà far luce sui possibili meccanismi di radio-resistenza, tendenza a recidivare del cordoma e allo sviluppo di agenti che possano avere come target il metabolismo dei ceramidi. Tali risultati dovrebbero essere validati in futuri studi clinici, in vitro e in vivo più ampi per confermare questo intricato legame tra il comportamento aggressivo del cordoma e dei ceramidi.