Studi preliminari sullo sviluppo di un metodo di rilevamento avanzato per l'individuazione precoce di diverse malattie su Solanum lycopersicum e Capsicum annuum

Introduzione Le malattie delle piante causano ogni anno perdite economiche e produttive all'agricoltura e richiedono quindi una diagnosi affidabile e precoce per un controllo efficace. Oggi le analisi di laboratorio rappresentano i metodi diagnostici più utilizzati. Questi test sono accurati e affidabili, ma anche costosi, invasivi e richiedono molto tempo, soprattutto se il numero di campioni è elevato. La tempestività dei trattamenti di protezione o della rimozione mirata delle piante infette gioca un ruolo fondamentale nel controllo della diffusione della malattia, che può essere anticipata attraverso l'identificazione dei sintomi a stadi pre-visibili o emergenti. Questi possono essere identificati con una diagnosi non distruttiva grazie ai recenti progressi nelle tecniche di rilevamento ottico. Lo scopo di questo progetto è quello di definire e validare un metodo per l'individuazione precoce di diversi patogeni su Solanum lycopersicum e Capsicum annuum. Questo lavoro si focalizza sui primi risultati ottenuti per due virus: Tobacco Mosaic Virus (TMV WT) e Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV). Materiali e Metodi Per questi esperimenti preliminari, dieci piante di pomodoro varietà ‘Rio Grande’ e dieci di peperone ‘Giallo d'Asti’ sono state inoculate con TMV e TSWV, affiancate da altrettante piante di controllo negativo inoculate solo con tampone Norit. Sette piante per ogni trattamento sono state utilizzate per acquisizioni con fluorimetro portatile Handy-Pea (Hansatech, UK) e con camera iperspettrale Hera (NIREOS, Italia) con risoluzione 3 nm nelle bande VIS-NIR (400-1000 nm). Le restanti piante sono state sottoposte a prelievi di tessuto fogliare da analizzare in laboratorio. La diffusione del virus è stata valutata rispettivamente a 2 (T1), 5 (T2), 9 (T3), 12 (T4), 15 (T5) e 19 (T6) giorni post-inoculo, eseguendo le misure con il fluorimetro, acquisendo immagini con la camera iperspettrale e campionando porzioni di foglie di 1 cm di diametro. Da queste è stato estratto l’RNA totale, retrotrascritto ed utilizzato per validare la presenza/assenza del virus all’interno della pianta tramite qPCR. Risultati Nelle piante di peperone inoculate con TMV gli indici della fluorescenza Fv/Fm, ETo/RC, PI abs e PI total diminuiscono nel tempo con il progredire dell'infezione (Fig. 1). Al contrario, Fo/Fm e DIo/RC aumentano con l'avanzare della malattia. Possiamo osservare un aumento di Fv/Fm e un decremento di Fo/Fm a partire da T2 (5 giorni post-inoculo) (Fig. 1). Risultati simili sono stati riscontrati in peperone infettato da TSWV e in piante di pomodoro inoculate con TMV e TSWV. Le immagini iperspettrali sono state processate con tecnica multivariata PCA e l’addestramento di una rete neurale al fine di discriminare le zone sintomatiche rispetto al tessuto normale. La rete neurale è stata addestrata con i valori di 117 lunghezze d’onda per ognuna delle 925 ROI (Region Of Interest) e 3 classi di output (sano / infetto / infetto pre-sintomo). Questo ha permesso di evidenziare i pre-sintomi a partire dal T1 nel 92,2% dei casi con un’accuratezza del modello dell’88,7%. In tabella 1 sono riportati i risultati relativi alla real-time PCR two-steps SYBR® Green in termociclatore StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM). Nei campioni positivi (+) è stata rilevata la presenza del virus mentre nei campioni negativi (-) il frammento non è stato amplificato. In verde/rosso sono riportati i valori dell’indice Fv/Fm rilevati dal fluorimetro. Infine la variabile Symp indica la comparsa di sintomi, anche molto precoci, dei virus rilevabile mediante un’attenta ispezione visuale delle piante. Conclusioni Questi risultati preliminari mostrano come la sostenibilità dei sistemi di gestione delle colture possa essere migliorata utilizzando soluzioni avanzate per la salute delle piante e la sicurezza alimentare.