Ischemic stroke is a neurological disorder representing a leading cause of death and permanent disability world-wide, for which effective regenerative treatments are still missing. Oligodendrocyte degeneration and consequent myelin disruption are considered major contributing factors to stroke-associated neurological deficits. Therefore, fostering myelin reconstruction through the generation of new myelinating oligodendrocytes has emerged as a promising therapeutic approach. Of note, the subpopulation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) expressing the P2Y-like receptor GPR17 has been shown to actively react to ischemic damage by increasing their proliferation and migration toward the lesion. However, their spontaneous differentiation capability remains very limited, likely due to non-permissive local inflammatory environment, which is mainly sustained by brain-resident microglia and blood-borne macrophages. Accumulating evidence has indeed shown that, immediately after stroke, microglial cells exert beneficial functions by promoting OPC recruitment toward the ischemic lesion and preserving myelin integrity, but these protective features are lost during lesion progression, contributing to remyelination failure. Thus, new strategies restoring microglia pro-remyelinating properties and unveiling the underlying mechanisms might provide important opportunities for both reducing myelin damage and promoting its regeneration by OPCs. On this basis, the general aim of the present thesis was to investigate the molecular mechanisms involved in the communication between microglia and OPCs after stroke, as well as the consequent implications for myelin repair. Given that secretion of extracellular vesicles (EVs) represents a key mechanism through which microglia influence the functions of neighboring cells, the first part of this study was aimed at understanding how exogenous microglia-derived EVs orchestrate the response of recipient microglia and OPCs following ischemic stroke. GPR17-iCreERT2:CAG-eGFP reporter mice were employed to trace the fate of GPR17-expressing OPCs, labeled by the green fluorescent protein (GFP), after permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAo). Infusion of exogenous regenerative microglia-derived EVs in the ipsilateral corpus callosum of mice at day 14 post-ischemia, corresponding to the late disease stage, restored protective microglia/macrophages functions, limiting their “senescence”, and enhanced the maturation of the pool of GFP+ OPCs accumulating at lesion borders, thus resulting in ameliorated neurological functionality. In vitro experiments showed a direct beneficial effect of pro-regenerative microglial EVs on OPC maturation, which is partly mediated by EV-carried transmembrane TNF. Moreover, gene expression profiling of OPCs exposed to microglial EVs shedded light on the early molecular changes responsible for enhanced maturation. Specifically, results highlighted that the protective action exerted by microglial EVs on recipient cells involves reprogramming of OPC energy metabolism, suggesting that manipulation of specific metabolic pathways in OPCs may provide novel therapeutic opportunities to promote remyelination in brain disorders. In the second part of this thesis, we evaluated the role of TNFR2, a transmembrane receptor previously implicated in regulating the pro-regenerative functions of microglia, in shaping microglial response after stroke, and its impact on remyelination and post-stroke recovery. To address this goal, conditional microglia-specific TNFR2 knockout mice and wild-type littermates have been subjected to pMCAo, and the effects of microglial TNFR2 ablation on stroke-induced motor disability, microglia phenotype, and OPC maturation have been assessed. Results unveiled signs of impaired motor performance in microglial TNFR2 knockout mice, accompanied by reduced expression of pro-regenerative microglial genes and by a significant decrease in OPC response to ischemic damage. These data suggest a role of TNFR2 signaling in driving the post-stroke microglia protective functions necessary to create the permissive local environment required for efficient remyelination. Altogether, the results of this thesis provide entirely new molecular mechanisms underpinning the beneficial interaction between microglia and OPCs, paving the way for developing new therapeutic strategies to promote myelin repair and functional recovery in neurodegenerative diseases.

L'ischemia cerebrale è un disturbo neurologico di origine cardiovascolare che rappresenta una delle principali cause di morte e disabilità permanente nel mondo, per il quale mancano terapie rigenerative efficaci. La degenerazione degli oligodendrociti e il conseguente deterioramento della guaina mielinica sono considerati tra i principali fattori che contribuiscono ai deficit neurologici associati a tale patologia. Pertanto, promuovere la riparazione della guaina mielinica attraverso la generazione di nuovi oligodendrociti mielinizzanti potrebbe rappresentare un approccio terapeutico promettente. A tale riguardo, è stato dimostrato che la sottopopolazione di precursori oligodendrocitari (OPC) esprimenti il recettore P2Y-simile GPR17 reagisce attivamente al danno ischemico aumentando il proprio tasso di proliferazione e migrando verso il sito di lesione. Tuttavia, il differenziamento spontaneo di queste cellule risulta molto limitato, probabilmente a causa dell'ambiente infiammatorio locale non permissivo, sostenuto principalmente dalla microglia residente nel sistema nervoso centrale e dai macrofagi provenienti dalla circolazione periferica. Prove crescenti mostrano infatti come le cellule microgliali inizialmente svolgano funzioni benefiche, promuovendo il reclutamento degli OPC verso la lesione ischemica e preservando l'integrità della mielina. Tuttavia, questi tratti protettivi vengono persi durante la progressione della lesione ischemica, contribuendo al fallimento del processo di rimielinizzazione. Pertanto, nuove strategie in grado di ripristinare le funzioni pro-rimielinizzanti della microglia e di elucidare i meccanismi alla base di tali proprietà benefiche potrebbero garantire nuove opportunità per ridurre il danno alla mielina e promuoverne la rigenerazione da parte degli OPC. Su queste basi, l'obiettivo generale di questa tesi è stato quello di indagare i meccanismi molecolari coinvolti nella comunicazione tra microglia e OPC dopo ischemia cerebrale, analizzando le conseguenti implicazioni per la riparazione della mielina. Dato che il rilascio di vescicole extracellulari (EV) rappresenta un importante meccanismo attraverso il quale la microglia influenza le funzioni delle cellule circostanti, la prima parte di questo studio ha avuto lo scopo di valutare gli effetti esercitati da EV microgliali esogene sulla risposta della microglia ricevente e degli OPC presenti ai margini della lesione ischemica. L’utilizzo di topi reporter GPR17-iCreERT2:CAG-eGFP ha permesso di tracciare, attraverso l’espressione della proteina fluorescente verde (GFP), il destino degli OPC esprimenti il recettore GPR17 dopo l'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO). L'infusione intracerebrale di EV esogene prodotte da microglia con fenotipo pro-rigenerativo a partire dal giorno 14 post-ischemia ha ripristinato le funzioni protettive di microglia e macrofagi presenti ai margini della lesione ischemica, limitandone la “senescenza”, e favorito il differenziamento del pool di OPC GFP+ a cellule mielinizzanti, con conseguente miglioramento della funzionalità neurologica. Ulteriori esperimenti in vitro hanno evidenziato come le EV prodotte da cellule microgliali con fenotipo pro-rigenerativo siano in grado di esercitare un effetto benefico diretto sulla maturazione dell'OPC, il quale è risultato essere in parte mediato dal TNF trasportato sulla transmembrana delle EV. Inoltre, un’analisi trascrittomica ha permesso di fare luce sui primi cambiamenti molecolari indotti negli OPC dall’esposizione a EV microgliali e responsabili del loro effetto pro-differenziante. Nello specifico, i risultati ottenuti hanno evidenziato come l'azione protettiva esercitata dalle EV microgliali sulle cellule riceventi comporti la riprogrammazione del metabolismo energetico degli OPC, suggerendo che la manipolazione di specifiche vie metaboliche negli OPC potrebbe aprire nuove prospettive terapeutiche per promuovere la rimielinizzazione in condizioni neuropatologiche. Nella seconda parte di questa tesi, è stato invece valutato il ruolo di TNFR2, un recettore transmembrana precedentemente implicato nella regolazione delle funzioni pro-rigenerative della microglia, nella regolazione della risposta microgliale dopo ischemia cerebrale, insieme al conseguente impatto sulla rimielinizzazione e sul recupero funzionale post-ischemico. Per raggiungere questo obiettivo, topi knockout microglia-specifici per TNFR2 e animali wild-type di controllo sono stati sottoposti a pMCAO con lo scopo di valutare gli effetti dell'ablazione di TNFR2 microgliale sulla disfunzione motoria post-ischemica, sul fenotipo della microglia e sulla maturazione dell'OPC. I risultati hanno rivelato segni di alterazione delle prestazioni motorie nei topi knockout per il TNFR2 microgliale, accompagnati da una ridotta espressione di geni associati a funzioni pro-rigenerative della microglia e da una significativa diminuzione della risposta degli OPC al danno ischemico. Questi dati suggeriscono un possibile ruolo di TNFR2 nel guidare le funzioni protettive della microglia dopo ischemia cerebrale, necessarie alla creazione di un ambiente locale permissivo che consenta un’efficiente rimielinizzazione. Complessivamente, i risultati inclusi nella presente tesi forniscono nuovi meccanismi molecolari alla base dell'interazione benefica tra microglia e OPC, aprendo la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche in grado di promuovere la riparazione della mielina e il recupero funzionale in condizioni neurodegenerative.

MICROGLIA-TO-OLIGODENDROCYTE PRECURSOR CELLS COMMUNICATION AFTER STROKE: MOLECULAR MECHANISMS AND IMPLICATIONS FOR MYELIN REPAIR / S. Raffaele ; tutor: M. Fumagalli ; coordinatore: G. D. Norata. Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, 2021 Dec 09. 34. ciclo, Anno Accademico 2021.

MICROGLIA-TO-OLIGODENDROCYTE PRECURSOR CELLS COMMUNICATION AFTER STROKE: MOLECULAR MECHANISMS AND IMPLICATIONS FOR MYELIN REPAIR

S. Raffaele
2021

Abstract

Ischemic stroke is a neurological disorder representing a leading cause of death and permanent disability world-wide, for which effective regenerative treatments are still missing. Oligodendrocyte degeneration and consequent myelin disruption are considered major contributing factors to stroke-associated neurological deficits. Therefore, fostering myelin reconstruction through the generation of new myelinating oligodendrocytes has emerged as a promising therapeutic approach. Of note, the subpopulation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) expressing the P2Y-like receptor GPR17 has been shown to actively react to ischemic damage by increasing their proliferation and migration toward the lesion. However, their spontaneous differentiation capability remains very limited, likely due to non-permissive local inflammatory environment, which is mainly sustained by brain-resident microglia and blood-borne macrophages. Accumulating evidence has indeed shown that, immediately after stroke, microglial cells exert beneficial functions by promoting OPC recruitment toward the ischemic lesion and preserving myelin integrity, but these protective features are lost during lesion progression, contributing to remyelination failure. Thus, new strategies restoring microglia pro-remyelinating properties and unveiling the underlying mechanisms might provide important opportunities for both reducing myelin damage and promoting its regeneration by OPCs. On this basis, the general aim of the present thesis was to investigate the molecular mechanisms involved in the communication between microglia and OPCs after stroke, as well as the consequent implications for myelin repair. Given that secretion of extracellular vesicles (EVs) represents a key mechanism through which microglia influence the functions of neighboring cells, the first part of this study was aimed at understanding how exogenous microglia-derived EVs orchestrate the response of recipient microglia and OPCs following ischemic stroke. GPR17-iCreERT2:CAG-eGFP reporter mice were employed to trace the fate of GPR17-expressing OPCs, labeled by the green fluorescent protein (GFP), after permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAo). Infusion of exogenous regenerative microglia-derived EVs in the ipsilateral corpus callosum of mice at day 14 post-ischemia, corresponding to the late disease stage, restored protective microglia/macrophages functions, limiting their “senescence”, and enhanced the maturation of the pool of GFP+ OPCs accumulating at lesion borders, thus resulting in ameliorated neurological functionality. In vitro experiments showed a direct beneficial effect of pro-regenerative microglial EVs on OPC maturation, which is partly mediated by EV-carried transmembrane TNF. Moreover, gene expression profiling of OPCs exposed to microglial EVs shedded light on the early molecular changes responsible for enhanced maturation. Specifically, results highlighted that the protective action exerted by microglial EVs on recipient cells involves reprogramming of OPC energy metabolism, suggesting that manipulation of specific metabolic pathways in OPCs may provide novel therapeutic opportunities to promote remyelination in brain disorders. In the second part of this thesis, we evaluated the role of TNFR2, a transmembrane receptor previously implicated in regulating the pro-regenerative functions of microglia, in shaping microglial response after stroke, and its impact on remyelination and post-stroke recovery. To address this goal, conditional microglia-specific TNFR2 knockout mice and wild-type littermates have been subjected to pMCAo, and the effects of microglial TNFR2 ablation on stroke-induced motor disability, microglia phenotype, and OPC maturation have been assessed. Results unveiled signs of impaired motor performance in microglial TNFR2 knockout mice, accompanied by reduced expression of pro-regenerative microglial genes and by a significant decrease in OPC response to ischemic damage. These data suggest a role of TNFR2 signaling in driving the post-stroke microglia protective functions necessary to create the permissive local environment required for efficient remyelination. Altogether, the results of this thesis provide entirely new molecular mechanisms underpinning the beneficial interaction between microglia and OPCs, paving the way for developing new therapeutic strategies to promote myelin repair and functional recovery in neurodegenerative diseases.
9-dic-2021
L'ischemia cerebrale è un disturbo neurologico di origine cardiovascolare che rappresenta una delle principali cause di morte e disabilità permanente nel mondo, per il quale mancano terapie rigenerative efficaci. La degenerazione degli oligodendrociti e il conseguente deterioramento della guaina mielinica sono considerati tra i principali fattori che contribuiscono ai deficit neurologici associati a tale patologia. Pertanto, promuovere la riparazione della guaina mielinica attraverso la generazione di nuovi oligodendrociti mielinizzanti potrebbe rappresentare un approccio terapeutico promettente. A tale riguardo, è stato dimostrato che la sottopopolazione di precursori oligodendrocitari (OPC) esprimenti il recettore P2Y-simile GPR17 reagisce attivamente al danno ischemico aumentando il proprio tasso di proliferazione e migrando verso il sito di lesione. Tuttavia, il differenziamento spontaneo di queste cellule risulta molto limitato, probabilmente a causa dell'ambiente infiammatorio locale non permissivo, sostenuto principalmente dalla microglia residente nel sistema nervoso centrale e dai macrofagi provenienti dalla circolazione periferica. Prove crescenti mostrano infatti come le cellule microgliali inizialmente svolgano funzioni benefiche, promuovendo il reclutamento degli OPC verso la lesione ischemica e preservando l'integrità della mielina. Tuttavia, questi tratti protettivi vengono persi durante la progressione della lesione ischemica, contribuendo al fallimento del processo di rimielinizzazione. Pertanto, nuove strategie in grado di ripristinare le funzioni pro-rimielinizzanti della microglia e di elucidare i meccanismi alla base di tali proprietà benefiche potrebbero garantire nuove opportunità per ridurre il danno alla mielina e promuoverne la rigenerazione da parte degli OPC. Su queste basi, l'obiettivo generale di questa tesi è stato quello di indagare i meccanismi molecolari coinvolti nella comunicazione tra microglia e OPC dopo ischemia cerebrale, analizzando le conseguenti implicazioni per la riparazione della mielina. Dato che il rilascio di vescicole extracellulari (EV) rappresenta un importante meccanismo attraverso il quale la microglia influenza le funzioni delle cellule circostanti, la prima parte di questo studio ha avuto lo scopo di valutare gli effetti esercitati da EV microgliali esogene sulla risposta della microglia ricevente e degli OPC presenti ai margini della lesione ischemica. L’utilizzo di topi reporter GPR17-iCreERT2:CAG-eGFP ha permesso di tracciare, attraverso l’espressione della proteina fluorescente verde (GFP), il destino degli OPC esprimenti il recettore GPR17 dopo l'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO). L'infusione intracerebrale di EV esogene prodotte da microglia con fenotipo pro-rigenerativo a partire dal giorno 14 post-ischemia ha ripristinato le funzioni protettive di microglia e macrofagi presenti ai margini della lesione ischemica, limitandone la “senescenza”, e favorito il differenziamento del pool di OPC GFP+ a cellule mielinizzanti, con conseguente miglioramento della funzionalità neurologica. Ulteriori esperimenti in vitro hanno evidenziato come le EV prodotte da cellule microgliali con fenotipo pro-rigenerativo siano in grado di esercitare un effetto benefico diretto sulla maturazione dell'OPC, il quale è risultato essere in parte mediato dal TNF trasportato sulla transmembrana delle EV. Inoltre, un’analisi trascrittomica ha permesso di fare luce sui primi cambiamenti molecolari indotti negli OPC dall’esposizione a EV microgliali e responsabili del loro effetto pro-differenziante. Nello specifico, i risultati ottenuti hanno evidenziato come l'azione protettiva esercitata dalle EV microgliali sulle cellule riceventi comporti la riprogrammazione del metabolismo energetico degli OPC, suggerendo che la manipolazione di specifiche vie metaboliche negli OPC potrebbe aprire nuove prospettive terapeutiche per promuovere la rimielinizzazione in condizioni neuropatologiche. Nella seconda parte di questa tesi, è stato invece valutato il ruolo di TNFR2, un recettore transmembrana precedentemente implicato nella regolazione delle funzioni pro-rigenerative della microglia, nella regolazione della risposta microgliale dopo ischemia cerebrale, insieme al conseguente impatto sulla rimielinizzazione e sul recupero funzionale post-ischemico. Per raggiungere questo obiettivo, topi knockout microglia-specifici per TNFR2 e animali wild-type di controllo sono stati sottoposti a pMCAO con lo scopo di valutare gli effetti dell'ablazione di TNFR2 microgliale sulla disfunzione motoria post-ischemica, sul fenotipo della microglia e sulla maturazione dell'OPC. I risultati hanno rivelato segni di alterazione delle prestazioni motorie nei topi knockout per il TNFR2 microgliale, accompagnati da una ridotta espressione di geni associati a funzioni pro-rigenerative della microglia e da una significativa diminuzione della risposta degli OPC al danno ischemico. Questi dati suggeriscono un possibile ruolo di TNFR2 nel guidare le funzioni protettive della microglia dopo ischemia cerebrale, necessarie alla creazione di un ambiente locale permissivo che consenta un’efficiente rimielinizzazione. Complessivamente, i risultati inclusi nella presente tesi forniscono nuovi meccanismi molecolari alla base dell'interazione benefica tra microglia e OPC, aprendo la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche in grado di promuovere la riparazione della mielina e il recupero funzionale in condizioni neurodegenerative.
Settore BIO/14 - Farmacologia
Microglia; Oligodendrocytes; Extracellular vesicles; Stroke; TNFR2; Remyelination; GPR17
https://hdl.handle.net/2434/808898
FUMAGALLI, MARTA
NORATA, GIUSEPPE DANILO
Doctoral Thesis
MICROGLIA-TO-OLIGODENDROCYTE PRECURSOR CELLS COMMUNICATION AFTER STROKE: MOLECULAR MECHANISMS AND IMPLICATIONS FOR MYELIN REPAIR / S. Raffaele ; tutor: M. Fumagalli ; coordinatore: G. D. Norata. Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, 2021 Dec 09. 34. ciclo, Anno Accademico 2021.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
phd_unimi_R12196.pdf

Open Access dal 16/05/2023

Descrizione: PhD thesis full text
Tipologia: Tesi di dottorato completa
Dimensione 4.38 MB
Formato Adobe PDF
4.38 MB Adobe PDF Visualizza/Apri
Pubblicazioni consigliate

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/2434/883201
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact