THE EFFECT OF TANNINS FROM CASTANEA SATIVA MILL. ON INFLAMMATION INDUCED BY HELICOBACTER PYLORI IN GASTRIC EPITHELIAL CELLS

The eradication therapy against Helicobacter pylori (H. pylori) accounts for the reduction of IL-8 levels in gastric mucosa and the related risk of gastric cancer and ulcer onset. However, the current therapeutic approach has being challenged by antibiotic resistance. The discovery of natural compounds from edible plants with anti-inflammatory and anti-bacterial activities may contribute to the control of the disease and improve the safety profile of eradication. Plants producing tannins, including ellagitannins, have already shown pre-clinical gastroprotective evidences, but pharmacological validations are still required. Accordingly, Castanea sativa Mill. (sweet chestnut) is a well-known source of tannins, traditionally used for gastro-intestinal and respiratory diseases. On the base of the traditional indication, extracts from sweet chestnut are currently allowed as botanical ingredients by several European countries; however, their phytochemical composition and biological activity are poorly investigated, thus limiting the substantiation of health claims. The aim of the phD project was to characterize hydroalcoholic extracts from fruit and leaves of sweet chestnut, with a particular attention to tannin composition. In parallel, extracts were evaluated as potential candidates against gastritis and H. pylori through a multidisciplinary approach, including in vitro pharmacological and microbiological experiments. In the view of nutraceutical application, the work took into account the importance of the botanical origin of the extracts and evaluated the impact of gastric digestion on the stability of natural compounds. The results obtained on the fruit (chestnut) have been published by the research group (Sangiovanni and Piazza et al. 2018): in brief, following a bio-guided approach, hydroalcoholic extracts from chestnut of five different varieties were screened for their ability to impair TNFα-induced IL-8 release in human gastric epithelial cells (AGS). Two varieties (Venegon and Verdesa) emerged for their promising inhibitory activity (IC50s less than 10 μg/mL) and further characterized for their polyphenolic content. HPLC-MS analysis revealed the presence of condensed tannins (oligomeric proanthocyanidins) in extracts from the outer part of chestnut (pericarp and episperm), which correlated with IL-8 impairment (IC50s less than 0.5 μg/mL); on the contrary, the edible part (endosperm) was devoid of proanthocyanidins and inactive. Of note, hydrolysable tannins typical of the bark of sweet chestnut, namely gallotannins and ellagitannins, were absent in chestnut. In line with the literature on tannins, extracts maintained their inhibitory activity after the simulation of gastric digestion. Moreover, the bioactivity was modestly affected by the application of brief thermal treatments (till 100 °C for 30 min), thus suggesting the possibility of recovering chestnut shell for the enrichment of a bioactive chestnut flour. Consequently, an episperm-fortified flour was prepared respecting the original composition of chestnut, then extracted and assayed again for IL-8 impairment (IC50 = 16.35 μg/mL), thus demonstrating the potential application of chestnut by- products in nutraceuticals. Following a similar approach, hydroalcoholic extracts from leaf belonging to the most promising varieties (Venegon and Verdesa) were investigated. Contrarily to the fruit, the ellagitannins castalagin and vescalagin were revealed (1-2%) in leaf, thus prompting further studies on the anti-H. pylori effect. In particular, the antibacterial and anti-inflammatory activity was evaluated in a co-culture model of gastric epithelial cells infected with the bacteria (tumoral AGS in comparison with non-tumoral GES- 1). Leaf extracts inhibited IL-8 release in both the infected cells with IC50s lower than 30 μg/mL and impaired the bacterial growth at 100 μg/mL. After simulated gastric digestion, these bioactivities were moderately impaired (2 folds); in paralleled, a slight decrease in total phenols content was observed, thus suggesting their possible stability at gastric level after oral consumption. Ellagitannins castalagin and vescalagin exhibited the same inhibitory effects (IC50 on IL-8 less than 16 μM; MIC = 25 μM), but at concentrations unable to completely explain the effect of the whole extract; therefore, the synergy with other polyphenols could play a role. The experimental work sustained for the first time the potential anti-gastritis application of by- products from sweet chestnut, such as chestnut shell and leaf, pointing out the role of tannins for the biological activity.

La terapia di eradicazione contro Helicobacter pylori (H. pylori) comporta la riduzione dei livelli di IL-8 nella mucosa gastrica e il controllo del rischio di cancro e ulcera. L’approccio terapeutico corrente è minacciato dall’antibiotico resistenza. Pertanto, la scoperta di composti vegetali di origine dietetica con effetto anti-infiammatorio e anti-batterico potrebbe contribuire al controllo della gastrite e migliorare il profilo di sicurezza della terapia. Le piante contenenti tannini, inclusi gli ellagitannini, hanno già dimostrato effetti gastro-protettivi in studi preclinici, ma richiedono ulteriore validazione farmacologica. Castanea sativa Mill. (castagno) rappresenta una fonte di tannini utilizzata tradizionalmente contro disturbi gastro-intestinali e respiratori. Gli estratti di C. sativa Mill. sono ammessi come ingredienti nutraceutici in diversi paesi europei sulla base del loro impiego tradizionale; d’altra parte, la loro composizione fitochimica e la loro attività biologica sono scarsamente studiate. Ciò comporta un limite per la documentazione di indicazioni salutistiche (health claims). L’obiettivo del seguente progetto di dottorato è stato di caratterizzare estratti idroalcolici ottenuti da frutti e foglie di C. sativa Mill., con un’attenzione particolare alla valutazione della composizione in tannini. In parallelo, gli estratti sono stati studiati come potenziali candidati contro la gastrite ed H. pylori, attraverso un approccio multidisciplinare che ha compreso esperimenti in vitro di tipo farmacologico e microbiologico. Nell’ottica di una possibile applicazione nutraceutica, il lavoro ha considerato l’importanza dell’origine botanica degli estratti e ha valutato l’impatto della digestione gastrica sulla stabilità dei composti bioattivi. I risultati conseguiti sugli estratti del frutto (la castagna) sono stati pubblicati dal gruppo di ricerca (Sangiovanni and Piazza et al. 2018): in breve, seguendo un approccio bio-guidato, gli estratti idroalcolici di frutti da 5 varietà di castagno sono stati utilizzati nel modello di rilascio di IL-8 indotta da TNFα in cellule epiteliali gastriche (AGS). Due delle varietà (Venegon e Verdesa) sono emerse per la loro attività inibitoria promettente (IC50 minore di 10 μg/mL) e di conseguenza sono state caratterizzate per il loro contenuto polifenolico. L’analisi HPLC-MS ha rilevato la presenza di tannini condensati (proantocianidine oligomeriche) negli estratti ottenuti dalle componenti esterne della castagna (pericarpo ed episperma), i quali hanno correlato con l’inibizione di IL-8 (IC50s minori di 0.5 μg/mL); al contrario, la parte edibile del frutto (l’endosperma) è risultato privo di proantocianidine e attività biologica. I tannini idrolizzabili tipici della corteccia di castagno, ovvero gallotannini ed ellagitannini, sono risultati assenti nel frutto. In accordo con la letteratura riguardante i tannini, gli estratti hanno mantenuto la loro attività inibitoria in seguito alla simulazione in vitro della digestione gastrica. Inoltre, l’attività biologica è stata modestamente intaccata da brevi trattamenti termici (fino a 100°C per 30 min), suggerendo la possibilità di recuperare le parti esterne per l’arricchimento di una farina di castagne bioattiva. Di conseguenza, una farina arricchita di episperma è stata preparata rispettando la composizione originale della castagna, quindi è stata estratta e valutata per l’inibizione di IL-8 (IC50 = 16.35 μg/mL), rivelando una potenziale applicazione nutraceutica. Seguendo un approccio simile sono stati studiati gli estratti idroalcolici delle foglie appartenenti alle varietà più promettenti (Venegon e Verdesa). Diversamente dal frutto, nella foglia sono stati riconosciuti gli ellagitannini castalagina e vescalagina (1-2%), i quali hanno stimolato l’approfondimento di un potenziale effetto contro H. pylori. In particolare, sono stati valutati l’effetto anti-batterico e anti-infiammatorio in un modello di co-coltura di cellule epiteliali gastriche infettate con il batterio (cellule tumorali AGS a confronto con cellule non-tumorali GES-1). Le foglie hanno inibito il rilascio di IL-8 con IC50 inferiori a 30 μg/mL in entrambi i modelli cellulari e hanno inibito la crescita batterica a 100 μg/mL. La simulazione della digestione gastrica ha moderatamente inficiato gli effetti biologici (2 volte) e il contenuto in fenoli totali, suggerendo la loro probabile stabilità a livello gastrico in seguito ad assunzione orale. Per gli ellagitannini castalagina e vescalagina è stato dimostrato lo stesso effetto inibitorio (IC50 di IL-8 minore di 16 μM; MIC = 25 μM), ma a concentrazioni che non spiegano completamente l’effetto dell’estratto originale; di conseguenza, la sinergia con altri polifenoli potrebbe giocare un ruolo. Il lavoro sperimentale ha posto le prime basi per il recupero a scopo nutraceutico di scarti agricoli della coltura del castagno, quali le parti esterne del frutto e le foglie, sottolineando il ruolo dei tannini per la loro attività biologica.