CHARACTERIZATION OF MOLECULAR MECHANISMS DRIVING EPIGENETIC CONVERSION AND PHENOTYPE SWITCH OF FIBROBLASTS INTO INSULIN SECRETING CELLS

Epigenetic conversion is a powerful technique that allows a mature somatic cell to switch into a different and alternative functional phenotype. The result is acquired without any transgenic modification, nor the acquisition of a stable and irreversible pluripotent state, making this approach very valuable for regenerative medicine. The protocol is robust, reproducible and ensures good functional efficiency, however, cells obtained are not completely mature and the optimal scale up conditions are needed for clinical translation. Aim of the present PhD project was to investigate whether the use of ambient conditions that try to closely mimic the physiological milieu, and limit the differences between in vitro and in vivo situations, may generate terminally differentiated cells and boost efficiency. To this purpose, physiological oxygen and different glucose concentrations were tested in order to assess cell responses and conversion ability in the different environments. In parallel, the use of three-dimensional (3D) culture systems was investigated, with the specific aim to study the impact of stiffness on epigenetic conversion and the acquisition of a functional, mature phenotype. The data obtained suggest that genetic background has a profound effect on the response to oxygen during the differentiation process and that conversion efficiency is strictly dependent on the glucose concentrations applied at cell isolation from the original tissue. 3D culture systems that match the stiffness typical of the original organ were able to increase differentiation and favored the acquisition of a mature pancreatic phenotype, distinctive of terminally differentiated cells. Last but not least, key molecular informations deriving from the ongoing gene editing experiments are expected to further clarify and substantiate the data obtained. Altogether, the information derived in this PhD project may find useful applications in order to design the best in vitro conditions and obtain a powerful scale-up protocol for pre-clinical studies and regenerative medicine of diabetes.

La conversione epigenetica è una tecnica promettente che consente ad una cellula somatica matura di passare ad un fenotipo funzionale diverso ed alternativo rispetto a quello di origine. Questo risultato viene perseguito senza alcuna modificazione transgenica e senza l'acquisizione di uno stato di pluripotenza stabile e irreversibile, caratteristiche che rendono questo approccio molto prezioso per la medicina rigenerativa. Il protocollo di conversione epigenetica è robusto, riproducibile e assicura una buona efficienza ed il conseguimento di un fenotipo funzionale. Tuttavia, le cellule ottenute non sono completamente mature e differenziate ed è necessario identificare le migliori condizioni per realizzare uno “scale-up” che permetta l’applicazione in studi preclinici. Lo scopo del presente progetto di dottorato è stato quello di individuare condizioni di coltura fisiologiche, limitando le differenze tra l’ambiente in vitro e quello in vivo, al fine di aumentare l'efficienza del processo di differenziamento. Più precisamente, sono state testate concentrazioni fisiologiche di ossigeno e di glucosio per poter valutare l’efficienza di conversione cellulare nei diversi ambienti. Parallelamente, è stato valutato l'uso di sistemi di coltura tridimensionale (3D), con lo scopo di studiare il loro impatto sull’efficienza di conversione e sull'acquisizione di un fenotipo funzionale e maturo. I dati ottenuti suggeriscono che il “background genetico” ha un effetto significativo sulla risposta cellulare alle diverse condizioni di ossigeno durante il processo di differenziamento. D’altro canto, l'efficienza di conversione è risultata strettamente dipendente dalle concentrazioni di glucosio utilizzate durante l’isolamento delle cellule dal tessuto di origine. Inoltre, l’utilizzo di sistemi di coltura 3D, che riflettono la rigidità e l’elasticità proprie dell'organo in vivo, ha dimostrato un effetto positivo per l'acquisizione di un fenotipo pancreatico maturo, tipico delle cellule terminalmente differenziate. Infine, le informazioni molecolari ottenute dagli esperimenti di “genome editing” (ancora in corso) dovrebbero ulteriormente chiarire e corroborare i dati ottenuti. Complessivamente, i risultati di questa tesi possono fornire informazioni utili sia per la comprensione dei meccanismi di base che regolano la crescita e il differenziamento cellulare, così come per la messa a punto di un protocollo di “scale-up” da utilizzare nella realizzazione di studi preclinici finalizzati alla medicina rigenerativa del diabete.