MOLECULAR FARMING APPLIED TO VETERINARY SCIENCE:NICOTIANA TABACUM PLANTS EXPRESSING ANTIGENIC PROTEINS FROM ESCHERICHIA COLI AS A MODEL OF EDIBLE VACCINE IN WEANED PIGLETS

Medical Molecular farming is a term used to refer to the production of valuable biopharmaceuticals in plants. An important branch of medical molecular farming is represented by the edible vaccines: engineered plants expressing major immunogenic proteins of pathogens that can be administered as subunit vaccines by oral route. Edible vaccines are particularly attractive due to low cost, heat stability, avoidance of injections and ability to induce specific antibodies in the mucosa, where enteric pathogens gain access to the body.The chances of acquiring mucosal immunity against infectious agents that enter the body across mucosal surface are also increases with the oral delivery of vaccines. This study is focused on seed-based vaccines against swine verocytotoxic Escherichia coli (VTEC). The third generation (R3) of two lines of Nicotiana tabacum expressing, respectively, the F18 adhesive fimbriae (n: 80) and the B subunit of the VT2e toxin (n: 80) of E. coli, were harvest in contention conditions (level 1). Four hundred and seventy grams of F18 positive seeds (F18s) and four hundred and fifty grams of VT2e-B positive seeds (VT2eBs) were collected. Even if no differences were observed in the germination index (F18s: 73.3%; VT2e-Bs: 76.6%; WT: 78.5%), F18s and VT2eBs germinated four days later than wild type. This aspect was probably related to late metabolic employment of inclusion bodies that we observed in the vaccinal seeds by morphological analyses. Polymerase chain reaction, carried out on DNA from vaccinal plants, confirmed the stable integration of the bacterial-origin genes into plant genome. The amount of F18 and VT2e-B was estimated respectively about 6.6-7.4 g and 34-37 g per 10 g seeds respectively by competitive indirect ELISA. The protective effect was evaluated, through an in-vivo trial, carried out at the Experimental Animal Research and Application Centre of the University of Milan, on 36 weaned piglets (controls, CG, n:18; treatment, TG, n:18) fed 20 g vaccinal seeds (10 g of each line) mixed with 40 g of milk powder on days 0, 1, 2, 5 and 14. Controls received wild type tobacco seeds in the same way. 12 piglets per group were challenged at day 20 with 1010 CFU of O138 E. coli. Throughout the experimental period (0-29 days), zootechnical performances and health status were monitored and biological samples were collected individually. After immunization period (day 20th), the titer of total intestinal IgAs resulted higher in the treated piglets, which showed also a significant increase of the fecal anti-F18 and anti-VT2e-B Immunoglobulin-A, if compared with controls. The adopted oral delivery strategy appeared effective in reducing clinical signs after VTEC infection and was able to stimulate local immunity in gastrointestinal tract. Finally, the knowledge in mucosal immunity was deepened in collaboration with the Department of Infectious Diseases, University of Denver, Colorado. In particular a method for characterizing the effects of different mucosal bacterial pathogens such as Moraxella catarrhalis, (Mcat), Heamophilus influenzae type b (Hib), Haemophilus influenzae non typeable (NTHi), Staphilococcus aureus Cowan I (SAC) on the isotype of antibody production from human B cells, was set up.

“Medical Molecular farming” o “Agricoltura molecolare” è un termine usato per indicare la produzione su larga scala di molecole ad interesse medico o farmaceutico in pianta. In tale ambito un’importate attenzione è rivolta ai vaccini edibili: piante ingegnerizzate per l’espressione di proteine immunogene in grado di indurre, dopo somministrazione orale, una risposta immunitaria locale protettiva nei confronti del patogeno contro il quale sono state progettate. I vaccini edibili offrono numerosi vantaggi correlati alla facilità di somministrazione, ai bassi costi, alla faciltà di stoccaggio nonché alla possibilità di indurre una risposta immunitaria locale laddove il patogeno ha accesso nell’organismo. Questo studio si concentra sui semi vaccinali contro i ceppi Escherichia coli verocitotossico (VTEC) nei suinetti. La terza generazione (R3) di semi di due linee di Nicotiana tabacum che esprimono, rispettivamente la fimbria adesiva F18 (n: 80) e la subunità B della tossina VT2e (n: 80) derivanti da un ceppo di E. coli verocitotossico, sono state coltivate in serra con un livello di contenimento 1. Nello specifico, sono stati raccolti quattrocentosettanta grammi di semi F18 positivi (F18s) e quattrocentocinquanta grammi di semi VT2e-B positivi (VT2eBs). Anche se, non sono state osservate differenze nell'indice di germinazione (F18s: 73,3%; VT2e-B: 76,6%; WT: 78,5%), i semi F18s e VT2eBs hanno germinato quattro giorni più tardi rispetto ai semi di Nicotiana tabacum “wild type”. Questo aspetto è probabilmente correlato all’uso tardivo dei corpi di inclusione (proteine e lipidi) da parte delle varietà ingegnerizzate, come osservato nei tessuti vegetali attraverso analisi morfologiche con microscopia ottica ed elettronica. Le analisi di PCR, effettuate su DNA di piante vaccinali, hanno confermato l'integrazione stabile dei geni di origine batterica nel genoma vegetale. La quantità delle proteine F18 e VT2e-B è stata stimata essere rispettivamente circa 6,6-7,4 g e 34-37 g per 10 g di semi tramite saggi ELISA competitivo indiretto. L'effetto protettivo della somministrazione orale dei semi vaccinali nei confronti con ceppi VTEC è stato valutato, attraverso una sperimentazione in-vivo, effettuata presso il Centro Zootecnico Didattico Sperimentale dell'Università degli Studi di Milano. Nello specifico 36 suinetti svezzati a 21 giorni sono stati suddivisi casualmente in due gruppi sperimentali: controllo (CG, n:18) e trattamento (TG, n:18). Considerando l’inizio della sperimentazione il giorno 0, i soggetti del gruppo TG hanno ricevuto nei giorni 0, 1, 2, 5 e 14 un trattamento corrispondente a 20 g di semi vaccinali macinati miscelati con 40 grammi di latte ricostituito in polvere. Il gruppo controllo ha invece ricevuto 20 g di semi di tabacco wild type. Al giorno 20, 12 suinetti rispettivamente del gruppo controllo e del gruppo trattamento sono stati infettati sperimentalemente con 1010 CFU del sierotipo O138 di E. coli. Durante tutto il periodo sperimentale (0-29 giorni), performances zootecniche e stato di salute sono stati monitorati e sono stati raccolti individualmente campioni biologici. Dopo il periodo di immunizzazione (giorno 20), il titolo di IgA intestinali totali è risultato essere superiore nei suinetti trattati, che inoltre mostravano un significativo aumento del titolo fecale di immunoglobuline A anti-F18 e anti-VT2e-B rispetto ai controlli. La strategia adottata, tramite somministrazione orale è risultata efficace nel ridurre i segni clinici dopo l'infezione da VTEC ed è stata in grado di stimolare l'immunità locale nel tratto gastroenterico. Inoltre, la conoscenza delle tecniche immunologiche e un approfondimento sull’immunità mucosale locale sono state sviluppate in collaborazione con l’Università di Denver, Colorado. In particolare è stato messo a punto un metodo per caratterizzare gli effetti di diversi batteri patogeni mucosali, come Moraxella catarrhalis, (Mcat), Heamophilus influenzae di tipo b (Hib), Haemophilus influenzae non tipizzabile (NTHi), Staphilococcus aureus Cowan I (SAC) sulla produzione di anticorpi di cellule B umane.