INNOVATIVE APPROACHES FOR THE CLINICO-PATHOLOGICAL DIAGNOSIS OF FELINE INFECTIOUS PERITONITIS AND FELINE CORONAVIRUS INFECTION

Feline infectious peritonitis (FIP) is a deadly disease of felids with a viral and immune-mediated pathogenesis. The nature of the etiological agent – feline coronavirus, FCoV – and the non specific clinical presentation make this disease particularly challenging both from a pathogenetic and a diagnostic point of view. Many aspects still represent an issue, like not knowing the mutation(s) responsible for the development of FIP, the lack of a gold standard for the diagnosis of FIP in vivo and the absence of an effective treatment. This thesis was aimed to clarify some of these aspects, specifically: a novel test on effusions was developed (namely, Δ total nucleated cell count – ΔTNC – i.e. the ratio between the two white blood cell count provided by the Sysmex XT-2000iV analyzer) (studies I and II); the frequency of atypical serum protein electrophoresis (SPE) patterns in cats with FIP, anecdotally reported during our diagnostic activity (study III) was investigated, a comparison of clinico-pathological and molecular tests for the diagnosis of FIP (study IV) was performed, a loop isothermal amplification method (LAMP) for the detection of FCoV was developed(study V) and an investigation on the prevalence of two mutations of the spike (S) protein gene in a wide number of samples from FIP and non-FIP cats was carried out (this latter study developed during an externship at the University of Bristol in collaboration with Prof. Séverine Tasker and Dr. Emi Barker) (study VI). The results of studies I and II demonstrated that the ΔTNC is a reliable method to support the diagnosis of FIP either on fresh or on frozen effusions. Study III confirmed that SPE profiles consistent with FIP are less frequent in recent years than in the past, possibly due to changes in the pathogenic characteristics of the FCoVs. However, study IV demonstrated that: on blood molecular tests may support a clinical diagnosis of FIP but none of the test, except the measurement of a1 acid-glycoprotein (AGP) may rule out this disease; cytology should be preferred on effusions either to exclude or confirm the disease and, on tissues, S gene sequencing should be preferred when histology is highly consistent with FIP while 3’ UTR PCR when FIP is less likely; the LAMP method developed in study V may be used to confirm the presence of FCoVs in the samples but is poorly sensitive and cannot exclude the presence of FCoVs. Finally, pyrosequencing of FCoV performed in study VI demonstrated the presence of gene S mutations also in FCoVs from fecal samples. The analysis of sequences recorded in this latter study, however, is still ongoing and future results may provide new insights on the pathogenesis and diagnosis of FIP.

La peritonite infettiva felina (FIP) è una patologia letale dei felidi, a patogenesi virale ed immunomediata. La propensione dell’agente eziologico alle mutazioni – coronavirus felino, FCoV – e la sintomatologia spesso aspecifica, rendono questa patologia complessa sia dal punto di vista diagnostico che patogenetico. Non si è ancora a conoscenza, infatti, della mutazione virale responsabile della patologia, non esiste ancora un gold standard per la diagnosi intra vitam e non è ancora disponibile una terapia valida. Lo scopo di questa tesi è di tentare di chiarire alcuni di questi aspetti. I primi due obiettivi (studio I e II) erano diretti allo sviluppo di un test per la diagnosi di FIP in forma effusiva. In particolare, è stata valutata l’accuratezza diagnostica del valore ottenuto dal rapporto tra le due conte leucocitarie fornite dal Sysmex XT-2000iV (Δ total nucleated cell count – TNCC) su campioni di versamento FIP indotto. Successivamente, è stato valutata la possibilità di effettuare lo stesso test su surnatanti di versamenti dopo aggiunta di sangue intero felino, in modo da poter ottenere questo valore su campioni congelati o con risultati dubbi ad altri esami. Il terzo scopo (studio III) era volto a confermare o smentire la presenza di pattern elettroforetici atipici in corso di FIP, come registrato nel nostro laboratorio negli ultimi anni. E’ stato quindi svolto uno studio retrospettivo per confrontare pattern elettroforetici in due periodi di tempo diversi. Il quarto obiettivo (studio IV) si prefissava di valutare l’accuratezza diagnostica di diversi test, sia clinico patologici che molecolari, per trovare il miglior test o la miglior combinazione di test per la diagnosi di FIP in vivo. Nello stesso studio è stato anche valutato il sequenziamento del gene spike (S), ultimamente proposto come discriminante, quando mutato, tra i due patotipi del FCoV. Il quinto scopo (studio V) era di mettere a punto una metodica molecolare isotermica (loop isothermal amplification method – LAMP) per il rilevamento del FCoV. Questa metodica, essendo veloce ed economica, potrebbe facilitare l’identificazione dei gatti eliminatori del FCoV o, per alcuni campioni, la diagnosi di FIP. Durante il mio percorso di dottorato ho anche partecipato ad un progetto sotto la supervisione della prof. Séverine Tasker e della dott.ssa Emi Barker dell’università di Bristol. Questo progetto (studi VI e VI.1) ha lo scopo di scoprire la vera prevalenza, in un ampio numero di tessuti, fluidi e feci ottenute da gatti affetti e non affetti da FIP, di due mutazioni del gene spike considerate ultimamente come co-responsabili della FIP. Gli studi I e II hanno dimostrato che il ΔTNC può essere usato per diagnosticare la FIP con buona accuratezza. Lo studio III ha confermato che i pattern elettroforetici tipici di FIP sono meno frequenti negli ultimi anni, possibilmente per modificazioni nella patogenicità dei FCoVs. Dallo studio IV si evince che i test molecolari possono confermare la diagnosi di FIP, ma che solo l’AGP puo’ escluderla; l’esame citologico dei versamenti dovrebbe essere il test di scelta sui versamenti, mentre sui tessuti il sequenziamento del gene S dovrebbe essere usato per confermare la diagnosi, mentre la PCR 3’ UTR PCR quando la FIP è meno probabile. La metodica LAMP sviluppata nello studio V si è rivelata molto specifica ma poco sensibile, dimostrandosi un buon test per confermare la presenza di FCoV in campioni biologici, ma non per escluderla. Infine, lo studio VI ha messo in evidenza la presenza di coronavirus mutati anche nelle feci di gatti non affetti da FIP, mostrando che i successivi progressi in questo studio metteranno in evidenza nuovi aspetti della patogenesi della FIP.