Il comet test quale mezzo di evidenza del danno apoptotico

Il comet test è una tecnica elettroforetica per evidenziare la frammentazione del DNA a livello della singola cellula. È una tecnica sensibile per evidenziare siti alcalo labili, rotture a singolo e doppio filamento, in genere danni che sono indotti da agenti genotossici e mutageni. Il tipo di migrazione del nucleo, l’intensità di fluorescenza, la lunghezza della coda che si forma sono correlati al numero di frammenti di DNA che migrano con velocità diverse rispetto al nucleo intatto. Tale tecnica elettroforetica può essere utilizzata per evidenziare anche un processo apoptotico visto che la frammentazione del DNA è un evento importante nella fase finali di questo processo. Per una corretta valutazione del danno genotossico è quindi importante capire e poter valutare quanto gli eventi apoptotici si sovrappongano e diano falsi positivi od overespressione di danno. Per questo scopo sono stati confrontati gli effetti di sostanze tipicamente apoptotiche, genotossiche o stimoli necrotici su due cloni della linea cellulare MCF7, rispettivamente uno sensibile e l’altro resistente all’apoptosi, utilizzando analisi FACS e comet test neutro e alcalino. I nostri dati indicano chiaramente che il comet test condotto in ambiente alcalino (comet alcalino) evidenzia il danno al DNA conseguente allo shock termico (20-30 minuti a 56°C) in entrambi i cloni cellulari, mentre non è indicativo per evidenziare un danno indotto da uno stimolo tipicamente apoptico per questo tipo di cellule (Taxolo 10 nM). Il comet test eseguito in ambiente neutro (comet neutro) evidenzia frammentazione del DNA dopo trattamento con l’agente apoptogeno (Taxolo 10nM) solo nel clone sensibile all’apoptosi, confermata con analisi FACS e liberazione dei ROS. Questi dati, in accordo con dati di letteratura su una diversa linea cellulare, indicano che il comet in ambiente neutro è la tecnica più adatta per evidenziare rotture a doppio filamento del DNA tipiche delle fasi finali dell’apoptosi e che il comet alcalino è da considerare un test specifico per l’evidenza di danno unicamente genotossico (rotture a singolo filamento).