Modelling delle porzioni transmembrana ed extracellulare del recettore mGluR5 e docking di molecole a nucleo isotiazolico

Modelling delle porzioni transmembrana ed extracellulare del recettore mGluR5 e docking di molecole a nucleo isotiazolicoIl modello recettoriale della porzione transmembrana è stato generato partendo dalla struttura amminoacidica primaria (codice UniProtKB P41594) tramite modelling comparativo utilizzando la struttura della Rodopsina Bovina (codice PDB 1F88) come templato. In questa prima fase di particolare aiuto ci è stato il software SwissPDBViewer[1], che permette una correzione manuale dell’ allineamento di sequenza correlata ad una valutazione istantanea del guadagno energetico risultante. La struttura cosi ottenuta è stata sottoposta ad un breve ciclo di minimizzazione ed equilibratura, permettendoci così di migliorare la qualità del nostro recettore grezzo soprattutto in virtù del miglioramento del grafico di Ramachandran degli amminoacidi presenti. Il modello della porzione transmembrana (TMD) del mGluR5 risultante è stato inserito in una membrana costituita da POPC precedentemente equilibrata e, per meglio simulare l’ambiente fisiologico, l’intero sistema è stato opportunamente solvatato con acqua e ioni. Dopo una prima fase di minimizzazione, abbiamo sottoposto la struttura proteica ad un processo di Simulated Annealing, favorendo le interazioni idrofobiche del core amminoacidico con le porzioni idrofobiche ed idrofiliche dell’intero sistema. Le successive fasi di minimizzazione ed equilibratura sono state eseguite utilizzando il force field CHARMM implementato nel software NAMD[2], permettendoci così di ottenere un modello ottimizzato attraverso simulazioni di 10 ns a temperatura e pressione costante (NPT). L'homology modelling sfrutta le proteine la cui struttura è stata determinata sperimentalmente allo scopo di predire la conformazione di un'altra proteina a struttura 3D incognita che abbia però una sequenza amminoacidica nota. Nel nostro caso ci siamo avvalsi della struttura cristallizzata del mGluR1ATD (codice PDB 1EWT). L’allineamento delle sequenze è stato ottenuto con il server T-Coffee. Riportando in un grafico gli angoli phi in funzione dei corrispondenti psi, si ottiene il cosiddetto grafico di Ramachandran, in cui si individuano 3 regioni ben definite corrispondenti alle coppie di valori consentiti. Il 99.1% di tutti i residui del nostro modello si trovano nelle cosiddette “regioni permesse”. L’unico outlier risulta essere il residuo Ser98 (phi, psi = -80.95, -131.9). Interessante è anche l’utilizzo del server PSIPRED[3]: PSIPRED è un programma che, a partire dagli allineamenti generati da PSI-BLAST, fornisce una previsione della struttura secondaria con un grado di accuratezza che si aggira intorno al 78%, secondo le stime fornite dal server stesso. Scopo del lavoro è analizzare mediante la tecnica del docking molecolare alcuni composti a nucleo isotiazolico potenzialmente utilizzabili come ligandi del recettore mGluR5, sfruttando la struttura 3D ottenuta precedentemente. A tal fine si è fatto uso del programma AutoDock 3.0.5[4.5], scegliendo come funzione di valutazione delle possibili conformazioni l’Algoritmo Genetico Lamarckiano[6], ibrido di un algoritmo genetico combinato con una ricerca locale delle configurazioni di minimo dell’energia d’interazione. Docking Parameters: • Number of individuals in population 50 • Maximum number of energy evaluations 500000 • Maximum number of generations 27000 • Cluster tolerance (Angstroms) 0.5 • ga_run 200 with cluster analysis on results • Il miglior risultato è rappresentato dal Composto 5. • Le interazioni riportate mostrano chiaramente l’importanza della distribuzione elettronica a livello dei gruppi carbossilato, stabilizzati dalla rigidità dell’anello condensato. • La catena laterale amminoacidica gioca un ruolo fondamentale stabilizzando la geometria attraverso un legame idrogeno intramolecolare ed un legame idrogeno tra il carbossilato ed il residuo Tyr43. • Gli sviluppi futuri riguardano l’estensione delle procedure di docking anche ad altri recettori mGluRs, al fine di comprendere i parametri elettronici in grado di determinare selettività d’azione. • Inoltre, attraverso l’utilizzo delle procedure di Metadinamica, ci proponiamo di valutare le energie di docking durante l’attivazione e il successivo cambiamento conformazionale del recettore. • ] Guex N. and Peitsch M.C.; “SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling”. Electrophoresis, 1997, 18, 2714-2723. • [2] Phillips J. C., Braun R., Wang W., Gumbart J., Tajkhorshid E., Villa E., Chipot C., Skeel R. D., Kale L. and Schulten K.; “Scalable molecular dynamics with NAMD”. Journal of Computational Chemistry, 2005, 26,1781-1802. • [3] Jones DT. (1999) Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292: 195-202. • [4] Goodsell, D.S. and Olson, A.J. (1990) Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:195-202. • [5] Morris, G.M., Goodsell, D.S., Huey, R. and Olson, A.J. (1996) Distributed Automated Docking of Flexible Ligands to Proteins: Parallel Applications of AutoDock 2.4. J. Computer-Aided Molecular Design 10:293-304. • [6] Morris, G.M., Goodsell, D.S., Halliday, R.S., Huey, R., Hart, W.E., Belew, R.K., Olson, A.J. (1998) Automated docking using Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. J. Comp. Chem. 19:1639-1662.