ROLE OF BLUEBERRY POLYPHENOLS ON MARKERS OF OXIDATIVE STRESS, INFLAMMATION AND HEPATIC LIPID ACCUMULATION

In the last decades, the epidemic of obesity, metabolic syndrome, chronic and degenerative diseases has becoming an emerging health problem in Western Countries with serious economic penalties on health care management. As a consequence, there is a strong demand for preventive strategies that could be easily applied by the majority of the population. Lifestyle and dietary behavior are both major risk and protective factors in the development and progression of chronic diseases. Preventive approaches acting on dietary habits would be able not only to decrease the risk of developing degenerative diseases but also to reduce the complications associated with aberrant metabolic states or already established disorders. Dietary guidelines generally recommend the consumption of fruits and vegetable rich in bioactive compounds such as berries. Besides the recognized biological properties of bioactives and in particular polyphenols, little is known on their mechanisms of action and potential synergistic or antagonistic effects. This is partially due to the paucity of well-designed dietary intervention studies and to the lack of investigations on the effects of single compounds and their metabolites in appropriate models and conditions. The objective of the PhD thesis was to study the role of blueberry bioactive compounds in the modulation of markers of oxidative stress, inflammation and hepatic lipid accumulation evaluated through an in vivo and an in vitro study approach. The first part of the thesis was focused on the investigation of blueberry polyphenols ability to modulate several biomarkers related to oxidative stress in young smoker volunteers. We previously documented that a single portion of blueberry was able to counteract the impairment of endothelial dysfunction and the increase in blood pressure caused by acute cigarette smoke. On the same volunteers we analyzed, after blueberry intake, the variations in the levels of oxidative stress markers potentially involved in the endothelial dysfunction observed. We did demonstrate neither an increase in antioxidant defense nor a reduction of oxidative stress markers following blueberry consumption. Moreover, we did not document a significant worsening in DNA oxidative damage in peripheral blood mononuclear cells after smoking or an improvement in DNA damage protection after blueberry intake. The second part of the thesis was performed in the laboratory of Internal Medicine and Metabolic Diseases, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico and focused on the potential ability of different fractions extracted from a wild blueberry powder rich in ACNs and phenolic acids to counteract lipid accumulation in HepG2 human hepatocytes supplemented with fatty acids (OA, oleic acid and PA, palmitic acid). In particular, we tested ACN and phenolic fractions, as well as the single ACNs and their metabolites in doses achievable through dietary intake. We observed that both ACNs and phenolic fraction were able to reduce significantly lipid accumulation at the concentrations of 0.1 µM and 1 µM compared to OA+PA treatment (p<0.05). Moreover, supplementation with single compounds showed different effects depending on the type of molecule considered suggesting a possible synergistic effect when a mix of compounds is present. No significant effect was observed for any of the metabolites. In conclusion, through this PhD thesis, important results were added to the analysis and the comprehension of the molecular mechanisms and of the role of blueberry polyphenols in the modulation of markers of oxidative stress and in the prevention of lipid accumulation. The in vivo investigation failed to demonstrate that the consumption of a single blueberry portion could modulate markers of oxidative stress and antioxidant defence. The in vitro approach supported the potential effect in counteracting lipid accumulation. Further studies are needed to explore the role, the doses and the molecular targets of action of blueberry polyphenols introduced through the diet.

Ruolo dei polifenoli del mirtillo sui marker di stress ossidativo, infiammazione e accumulo epatico di lipidi Negli ultimi anni la crescente epidemia di obesità, sindrome metabolica e di malattie cronico-degenerative è diventata un problema emergente nei paesi occidentali con un grave impatto economico sul sistema sanitario. Di conseguenza vi è una forte richiesta di strategie preventive facilmente fruibili dalla popolazione. Lo stile di vita e il comportamento alimentare sono senza dubbio fattori coinvolti sia nello sviluppo sia nella progressione delle malattie croniche. Strategie preventive che agiscano sulle abitudini dietetiche potrebbero essere in grado di ridurre il rischio di sviluppare malattie degenerative e le complicanze ad esse associate. Le linee guida per una sana alimentazione raccomandano l’assunzione di frutta e verdura ad alto contenuto di composti bioattivi come ad esempio i frutti di bosco. Oltre alle conosciute proprietà biologiche di questi composti ed in particolare dei polifenoli, poco è noto sui meccanismi d’azione e il loro potenziale sinergico o agonistico. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di studi di intervento e di studi sulle proprietà dei singoli composti e dei loro metaboliti valutati in modelli e condizioni sperimentali appropriate. L’obiettivo della presente tesi di dottorato è stato quello di studiare il ruolo dei composti bioattivi del mirtillo nella modulazione di marker di stress ossidativo, infiammazione e accumulo epatico di lipidi attraverso approcci in vitro e in vivo. La prima parte della tesi è stata focalizzata sullo studio della capacità dei polifenoli del mirtillo di modulare alcuni biomarker di stress ossidativo in giovani volontari fumatori. In una sperimentazione precedente era stato dimostrato, che l’assunzione di una porzione di mirtillo era in grado di contrastare il peggioramento della funzione endoteliale e l’aumento della pressione causati dal fumo di una sigaretta. Pertanto, è stato effettuato uno studio sullo stesso gruppo di soggetti per valutare la variazione dei livelli di alcuni marker di stress ossidativo. I risultati non hanno evidenziato nè un aumento delle difese antiossidanti, né una riduzione dei marker di stress ossidativo. Inoltre, dopo il fumo non è emerso un aumento significativo del danno al DNA nelle cellule mononucleate separate da sangue periferico, né un miglioramento nella protezione del danno al DNA dopo l’assunzione di mirtillo. La seconda parte, svolta nel laboratorio di Medicina interna e malattie metaboliche, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, ha avuto come obiettivo lo studio della capacità di frazioni estratte da un liofilizzato di mirtillo selvatico, ricco in antociani e composti fenolici, di ridurre l’accumulo di lipidi in cellule di epatocarcinoma HepG2 supplementate con acidi grassi (OA, acido oleico e PA, acido palmitico). In particolare, sono state testate le frazioni antocianiche e fenoliche, nonché i singoli antociani e corrispettivi metaboliti, in dosi raggiungibili attraverso la dieta. I risultati hanno evidenziato che entrambe le frazioni erano in grado di ridurre l’accumulo di lipidi nelle concentrazioni pari a 0.1 µM and 1 µM rispetto al trattamento con i soli acidi grassi. Inoltre, la supplementazione con i singoli composti mostrava effetti differenti e specifici in funzione del tipo di molecola utilizzata, suggerendo un potenziale effetto sinergico esercitato dei composti presenti nelle frazioni. Nessun effetto significativo è stato ottenuto con i metaboliti. In conclusione, attraverso questa tesi di dottorato, è stato possibile aggiungere alcuni risultati utili per l’analisi e la comprensione del ruolo dei polifenoli del mirtillo nella modulazione di marker di stress ossidativo e nella prevenzione dell’accumulo epatico di lipidi. Lo studio in vivo non ha permesso di dimostrare una modulazione dei marker di stress ossidativo e di difesa antiossidante a seguito del consumo di una porzione di mirtillo, mentre lo studio in vitro ha mostrato un effetto dei bioattivi testati nel contrastare l’accumulo di lipidi. Ulteriori studi saranno sviluppati per esplorare il ruolo, le dosi e i target molecolari di azione dei polifenoli del mirtillo introdotti attraverso la dieta.