POSSmILITA' DI UTILIZZARE COLORANTI FLUORESCENTI PER LA MISURA DEL TRASPORTO DI METALLI PESANTI IN CELLULE DI RADICE Rivetta A., Negrini N. e Cocucci M. Dipartimento di Fisiologia delle Piante Coltivate e Chimica Agraria, Università di Milano 1 problemi legati alla misura del trasporto dei metalli pesant~ in particolare dei cationi bivalenti, attraverso il plasmalemma di cellule vegetali sono dovuti soprattutto alla presenza sulla parete cellulare di un elevato numero di siti in grado di legare tali cationi. Perciò non è facile distinguere la frazione del metallo che viene assorbita dalla cellula (simplastica) da quella che viene adsorbita a livello di parete cellulare (apoplastica). Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la possibilità di utilizzare un colorante fluorescente, in particolare il fura 2, per la misura del trasporto del Cd2+ attraverso il plasmalemma di protoplasti di radici di mais. TI fura 2 è una molecola che varia le proprie caratteristiche di fluorescenza in funzione dell'attività di Ca2+ nel mezzo (Ca2+ I nM - IO mM). Analogamente al Ca2+, in presenza di Cd2+ il fura 2 cambia lo spettro di fluorescenza ( eccitazione) spostando il punto di massimo da 380 verso 340 nrn. Cortecce di radice primaria di mais erano tagliate in segmenti di ca. 2 mm ed incubati per 3 h a 25°C in presenza di mannitolo 0,8 M ed enzimi maceranti (pectoliasi e cellulasi) ed i protoplasti così ottenuti erano purificati su un gradiente discontinuo di ficoll. Per ottenere il caricamento del fura 2 all'interno delle cellule, è stata utilizzata la sua forma acetossimetilata (fura 2/ AM), in quanto la forma acida (fura 2), essendo carica, risulta impermeabile alle membrane. Una sospensione di protoplasti molto concentrata era incubata per 30' in presenza di fura 2/ AM. Dopo un lavaggio, i protoplasti erano riportati a ca. 105 cellule mL-I . Lo spettro di fluorescenza di tale sospensione era simile a quello del fura 2/ AM, presentando un picco intorno a 390 nrn. Tale picco diminuiva nel tempo, indicando la deesterificazione del fura 2/ AM da parte delle cellule: dopo 2 h di incubazione a 26°C la forma dello spettro non variava sostanzialmente, risultando molto simile a quello del fura 2 acido in presenza di basse attività di Ca2+ TI fatto che durante la de-esterificazione non si osservino modificazioni sostanziali nella zona dello spettro intorno a 340 nm, neppure aggiungendo Ca2+ 500 mM nel mezzo, suggerisce che tale processo procedeva nella cellula, probabilmente nel cito sol, e che la quantità di colorante esterna, presente o per rilascio da parte delle cellule o per parziale rottura dei protoplasti, non era elevata. La presenza di Cd2+ nel mezzo esterno induceva una variazione della forma dello spettro di fluorescenza della popolazione di protoplasti, con una spostamento del picco verso 340 nrn che risultava sempre maggiore col passare del tempo di incubazione. Questi dati suggeriscono che il Cd2+ entra nelle cellule facendo variare lo spettro di fluorescenza del fura 2. Nonostante sia difficile, al momento, calcolare le concentrazioni di Cd2+ all'interno delle cellule, i risultati finora ottenuti indicano che il rapporto di fluorescenza 340/380 nrn aumentava all'aumentare della concentrazione di Cd2+ esterno (ImM - 20mM).

Possibilità di utilizzare coloranti fluorescenti per la misura del trasporto di metalli pesanti in cellule di radice / A. Rivetta, N. Negrini, M. Cocucci - In: Atti 15. Convegno Nazionale della Società Italiana di Chimica Agraria : Viterbo, 30 settembre- 2 ottobre 1997 / [a cura di] G. Giovannozzi Sermanni, M. Luna, M. Badiani. - Bologna : Patron, 1997. - ISBN 88-555-2460-7. - pp. 45-45 (( Intervento presentato al 15. convegno Convegno Nazionale della Società di Chimica Agraria tenutosi a Viterbo nel 1997.

Possibilità di utilizzare coloranti fluorescenti per la misura del trasporto di metalli pesanti in cellule di radice

A. Rivetta;N. Negrini;M. Cocucci
1997

Abstract

POSSmILITA' DI UTILIZZARE COLORANTI FLUORESCENTI PER LA MISURA DEL TRASPORTO DI METALLI PESANTI IN CELLULE DI RADICE Rivetta A., Negrini N. e Cocucci M. Dipartimento di Fisiologia delle Piante Coltivate e Chimica Agraria, Università di Milano 1 problemi legati alla misura del trasporto dei metalli pesant~ in particolare dei cationi bivalenti, attraverso il plasmalemma di cellule vegetali sono dovuti soprattutto alla presenza sulla parete cellulare di un elevato numero di siti in grado di legare tali cationi. Perciò non è facile distinguere la frazione del metallo che viene assorbita dalla cellula (simplastica) da quella che viene adsorbita a livello di parete cellulare (apoplastica). Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la possibilità di utilizzare un colorante fluorescente, in particolare il fura 2, per la misura del trasporto del Cd2+ attraverso il plasmalemma di protoplasti di radici di mais. TI fura 2 è una molecola che varia le proprie caratteristiche di fluorescenza in funzione dell'attività di Ca2+ nel mezzo (Ca2+ I nM - IO mM). Analogamente al Ca2+, in presenza di Cd2+ il fura 2 cambia lo spettro di fluorescenza ( eccitazione) spostando il punto di massimo da 380 verso 340 nrn. Cortecce di radice primaria di mais erano tagliate in segmenti di ca. 2 mm ed incubati per 3 h a 25°C in presenza di mannitolo 0,8 M ed enzimi maceranti (pectoliasi e cellulasi) ed i protoplasti così ottenuti erano purificati su un gradiente discontinuo di ficoll. Per ottenere il caricamento del fura 2 all'interno delle cellule, è stata utilizzata la sua forma acetossimetilata (fura 2/ AM), in quanto la forma acida (fura 2), essendo carica, risulta impermeabile alle membrane. Una sospensione di protoplasti molto concentrata era incubata per 30' in presenza di fura 2/ AM. Dopo un lavaggio, i protoplasti erano riportati a ca. 105 cellule mL-I . Lo spettro di fluorescenza di tale sospensione era simile a quello del fura 2/ AM, presentando un picco intorno a 390 nrn. Tale picco diminuiva nel tempo, indicando la deesterificazione del fura 2/ AM da parte delle cellule: dopo 2 h di incubazione a 26°C la forma dello spettro non variava sostanzialmente, risultando molto simile a quello del fura 2 acido in presenza di basse attività di Ca2+ TI fatto che durante la de-esterificazione non si osservino modificazioni sostanziali nella zona dello spettro intorno a 340 nm, neppure aggiungendo Ca2+ 500 mM nel mezzo, suggerisce che tale processo procedeva nella cellula, probabilmente nel cito sol, e che la quantità di colorante esterna, presente o per rilascio da parte delle cellule o per parziale rottura dei protoplasti, non era elevata. La presenza di Cd2+ nel mezzo esterno induceva una variazione della forma dello spettro di fluorescenza della popolazione di protoplasti, con una spostamento del picco verso 340 nrn che risultava sempre maggiore col passare del tempo di incubazione. Questi dati suggeriscono che il Cd2+ entra nelle cellule facendo variare lo spettro di fluorescenza del fura 2. Nonostante sia difficile, al momento, calcolare le concentrazioni di Cd2+ all'interno delle cellule, i risultati finora ottenuti indicano che il rapporto di fluorescenza 340/380 nrn aumentava all'aumentare della concentrazione di Cd2+ esterno (ImM - 20mM).
Settore AGR/13 - Chimica Agraria
1997
Società Italiana di Chimica agraria
Book Part (author)
File in questo prodotto:
Non ci sono file associati a questo prodotto.
Pubblicazioni consigliate

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/2434/266738
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact