Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disorder caused by the loss of motor neurons in the cerebral cortex, brainstem and spinal cord. ALS occurs prevalently as sporadic forms (SALS), but a small proportion of cases (5-10%) displays a positive family history (FALS), generally with an autosomal dominant pattern of inheritance. To date, more than 20 causative genes have been identified in FALS, providing fundamental insights into the pathogenic mechanisms and underlying the great genetic heterogeneity of the disease. Despite these numerous advances, the genetic basis of nearly 40% of FALS remains to be identified, while the genetic component of SALS is largely unknown. A powerful and innovative tool for genetic studies in ALS is represented by next-generation sequencing and in particular by the targeted sequencing of the coding part of the genome or exome. Aim of this research project was to identify novel genes associated to FALS and SALS by applying complementary approaches all based on exome sequencing, which overcomes the limitations of traditional genetic strategies. Methods: Three different disease gene identification strategies were applied: I) exome sequencing associated to linkage analysis in two large ALS dominant pedigrees; II) exome-wide rare variant burden analysis on 363 unrelated index FALS cases; III) exome sequencing of 32 SALS and their unaffected parents (trio-design). Results: I) By performing exome-sequencing in combination with linkage analysis, we identified PFN1 (profilin-1), encoding for a protein regulating actin dynamics, as a novel ALS-causative gene. Mutations in PFN1 were observed in ~2.6% of FALS and functional studies demonstrated aggregation propensity, reduction of actin binding ability and axonal outgrowth inhibition of mutant PFN1 proteins. II) As a result of the unbiased case-control rare variant analysis, applied on a total 12.495 genes, we identified TUBA4A (Tubulin, Alpha 4a) as candidate gene showing a statistically significant excess of rare damaging variants in 363 index FALS cases sequenced. Functional analysis revealed that ALS-related mutants were defective in forming alpha/beta tubulin dimers in vitro and in incorporating into microtubules in vivo. In addition, the truncated mutant TUBA4A p.W407X showed aggregation propensities. III) By sequencing the exomes of 32 SALS patients and their unaffected parents, we identified 25 de novo mutations (DNMs) in 16 of 32 trios, with an overall DNM rate of 0.78. Although we did not find recurrently mutated genes in our ALS trios, bionformatic analysis showed potential inter-connections between the candidate genes. Functional classification revealed that DNMs are enriched in genes encoding for proteins involved in transport and in GTPase regulatory activity. Conclusions: Our findings indicate that exome-sequencing, combined with different strategies for study design and data analysis, is an effective and successful approach for the identification of novel ALS causative genes. The identification of PFN1 and TUBA4A genes, encoding for proteins implicated, respectively, in actin polymerization and microtubule formation, further supports a major role of cytoskeletal defects in ALS pathogenesis.

Introduzione: La Sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale caratterizzata dalla perdita selettiva dei motoneuroni nella corteccia cerebrale, nel tronco cerebrale e midollo spinale. La maggior parte dei casi è costituita da forme sporadiche, mentre solo il 5-10% dei casi è rappresentato da forme familiari, causate da geni con modalità di trasmissione mendeliana, generalmente autosomica dominante. Sono stati identificati più di 20 geni causativi delle forme familiari, che hanno contribuito a comprendere meglio i meccanismi patogenetici coinvolti e sottolineano la grande eterogeneità genetica della malattia. Nonostante i numerosi progressi raggiunti, in circa il 40% dei casi familiari la causa genetica non è stata ancora identificata, mentre la componente genetica delle forme sporadiche è in gran parte sconosciuta. L’ applicazione delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione ed in particolare il sequenziamento della porzione codificante del genoma o esoma rappresenta un approccio innovativo e promettente per gli studi genetici sulla SLA. Lo scopo del presente progetto di ricerca di Dottorato è stato quello di identificare nuovi geni associati alle forme familiari e sporadiche di SLA mediante sequenziamento dell’esoma come metodo alternativo per superare i limiti delle tecniche genetiche tradizionali. Metodi: Sono state utilizzate tre diverse strategie per l’identificazione di geni causativi: I) sequenziamento dell’esoma in combinazione con analisi di linkage in due grandi famiglie SLA a trasmissione dominante; II) analisi per varianti rare degli esomi di 363 casi familiari singoli; III) sequenziamento dell’esoma in 32 casi di SLA sporadica e dei loro genitori non affetti (approccio dei trios). Risultati: I) Attraverso l’approccio combinato di sequenziamento dell’esoma ed analisi di linkage, abbiamo identificato il gene PFN1 (profilina-1), codificante per una proteina implicata nella regolazione dell’actina, come nuovo gene causativo di SLA. Mutazioni a carico del gene PFN1 sono state osservate nel 2,6% dei pazienti SLA familiari e gli studi funzionali condotti sui mutanti hanno dimostrato una maggiore tendenza all’aggregazione, una riduzione del legame all’actina ed un effetto inibitorio sulla crescita assonale. II) L’analisi delle varianti rare tra casi e controlli, applicata su un totale di 12.495 geni, ha portato all’identificazione di TUBA4A (codificante per lalfa-tubulina 4a) come gene candidato caratterizzato da un eccesso significativo di varianti rare potenzialmente dannose nei 363 casi familiari analizzati. L’analisi funzionale ha dimostrato per i mutanti di TUBA4A una capacità ridotta di dimerizzazione con la beta-tubulina in vitro ed un’alterata incorporazione nei microtubuli in vivo. Inoltre, il mutante tronco TUBA4A p.W407X ha mostrato una maggiore tendenza all’aggregazione. III) Infine, analizzando l’esoma di 32 pazienti con SLA sporadica e dei loro genitori non affetti, abbiamo identificato 25 mutazioni de novo in 16 dei 32 trios analizzati, con un tasso di mutazioni de novo pari a 0,78. Non sono stati identificati geni con molteplici mutazioni de novo nei trios sequenziati, ma le analisi bioinformatiche hanno mostrato possibili connessioni tra i geni candidati e la classificazione funzionale ha rilevato che le mutazioni de novo sono principalmente a carico di geni codificanti per trasportatori o per proteine con attività regolatoria sulle GTPasi. Conclusioni: I risultati ottenuti hanno dimostrato che il sequenziamento dell’esoma, applicato con specifiche strategie di studio e di analisi, è un approccio efficace per l’identificazione di nuovi geni causativi nella SLA. La scoperta dei due geni PFN1 e TUBA4A, codificanti per proteine coinvolte nel processo di polimerizzazione dell’actina e dei microtubuli, fornisce ulteriori evidenze a supporto del coinvolgimento del citoscheletro nella patogenesi della SLA.

EXOME SEQUENCING APPROACH TO IDENTIFY CAUSATIVE GENES FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS / C. Tiloca ; tutore: G. P. Comi ; co-tutore: V. Silani ; coordinatore: M. Clerici. - : . DIPARTIMENTO DI FISIOPATOLOGIA MEDICO-CHIRURGICA E DEI TRAPIANTI, 2015 Jan 20. ((27. ciclo, Anno Accademico 2014. [10.13130/tiloca-cinzia_phd2015-01-20].

EXOME SEQUENCING APPROACH TO IDENTIFY CAUSATIVE GENES FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS

C. Tiloca
2015

Abstract

Introduzione: La Sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale caratterizzata dalla perdita selettiva dei motoneuroni nella corteccia cerebrale, nel tronco cerebrale e midollo spinale. La maggior parte dei casi è costituita da forme sporadiche, mentre solo il 5-10% dei casi è rappresentato da forme familiari, causate da geni con modalità di trasmissione mendeliana, generalmente autosomica dominante. Sono stati identificati più di 20 geni causativi delle forme familiari, che hanno contribuito a comprendere meglio i meccanismi patogenetici coinvolti e sottolineano la grande eterogeneità genetica della malattia. Nonostante i numerosi progressi raggiunti, in circa il 40% dei casi familiari la causa genetica non è stata ancora identificata, mentre la componente genetica delle forme sporadiche è in gran parte sconosciuta. L’ applicazione delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione ed in particolare il sequenziamento della porzione codificante del genoma o esoma rappresenta un approccio innovativo e promettente per gli studi genetici sulla SLA. Lo scopo del presente progetto di ricerca di Dottorato è stato quello di identificare nuovi geni associati alle forme familiari e sporadiche di SLA mediante sequenziamento dell’esoma come metodo alternativo per superare i limiti delle tecniche genetiche tradizionali. Metodi: Sono state utilizzate tre diverse strategie per l’identificazione di geni causativi: I) sequenziamento dell’esoma in combinazione con analisi di linkage in due grandi famiglie SLA a trasmissione dominante; II) analisi per varianti rare degli esomi di 363 casi familiari singoli; III) sequenziamento dell’esoma in 32 casi di SLA sporadica e dei loro genitori non affetti (approccio dei trios). Risultati: I) Attraverso l’approccio combinato di sequenziamento dell’esoma ed analisi di linkage, abbiamo identificato il gene PFN1 (profilina-1), codificante per una proteina implicata nella regolazione dell’actina, come nuovo gene causativo di SLA. Mutazioni a carico del gene PFN1 sono state osservate nel 2,6% dei pazienti SLA familiari e gli studi funzionali condotti sui mutanti hanno dimostrato una maggiore tendenza all’aggregazione, una riduzione del legame all’actina ed un effetto inibitorio sulla crescita assonale. II) L’analisi delle varianti rare tra casi e controlli, applicata su un totale di 12.495 geni, ha portato all’identificazione di TUBA4A (codificante per lalfa-tubulina 4a) come gene candidato caratterizzato da un eccesso significativo di varianti rare potenzialmente dannose nei 363 casi familiari analizzati. L’analisi funzionale ha dimostrato per i mutanti di TUBA4A una capacità ridotta di dimerizzazione con la beta-tubulina in vitro ed un’alterata incorporazione nei microtubuli in vivo. Inoltre, il mutante tronco TUBA4A p.W407X ha mostrato una maggiore tendenza all’aggregazione. III) Infine, analizzando l’esoma di 32 pazienti con SLA sporadica e dei loro genitori non affetti, abbiamo identificato 25 mutazioni de novo in 16 dei 32 trios analizzati, con un tasso di mutazioni de novo pari a 0,78. Non sono stati identificati geni con molteplici mutazioni de novo nei trios sequenziati, ma le analisi bioinformatiche hanno mostrato possibili connessioni tra i geni candidati e la classificazione funzionale ha rilevato che le mutazioni de novo sono principalmente a carico di geni codificanti per trasportatori o per proteine con attività regolatoria sulle GTPasi. Conclusioni: I risultati ottenuti hanno dimostrato che il sequenziamento dell’esoma, applicato con specifiche strategie di studio e di analisi, è un approccio efficace per l’identificazione di nuovi geni causativi nella SLA. La scoperta dei due geni PFN1 e TUBA4A, codificanti per proteine coinvolte nel processo di polimerizzazione dell’actina e dei microtubuli, fornisce ulteriori evidenze a supporto del coinvolgimento del citoscheletro nella patogenesi della SLA.
COMI, GIACOMO PIETRO
CLERICI, MARIO SALVATORE
Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disorder caused by the loss of motor neurons in the cerebral cortex, brainstem and spinal cord. ALS occurs prevalently as sporadic forms (SALS), but a small proportion of cases (5-10%) displays a positive family history (FALS), generally with an autosomal dominant pattern of inheritance. To date, more than 20 causative genes have been identified in FALS, providing fundamental insights into the pathogenic mechanisms and underlying the great genetic heterogeneity of the disease. Despite these numerous advances, the genetic basis of nearly 40% of FALS remains to be identified, while the genetic component of SALS is largely unknown. A powerful and innovative tool for genetic studies in ALS is represented by next-generation sequencing and in particular by the targeted sequencing of the coding part of the genome or exome. Aim of this research project was to identify novel genes associated to FALS and SALS by applying complementary approaches all based on exome sequencing, which overcomes the limitations of traditional genetic strategies. Methods: Three different disease gene identification strategies were applied: I) exome sequencing associated to linkage analysis in two large ALS dominant pedigrees; II) exome-wide rare variant burden analysis on 363 unrelated index FALS cases; III) exome sequencing of 32 SALS and their unaffected parents (trio-design). Results: I) By performing exome-sequencing in combination with linkage analysis, we identified PFN1 (profilin-1), encoding for a protein regulating actin dynamics, as a novel ALS-causative gene. Mutations in PFN1 were observed in ~2.6% of FALS and functional studies demonstrated aggregation propensity, reduction of actin binding ability and axonal outgrowth inhibition of mutant PFN1 proteins. II) As a result of the unbiased case-control rare variant analysis, applied on a total 12.495 genes, we identified TUBA4A (Tubulin, Alpha 4a) as candidate gene showing a statistically significant excess of rare damaging variants in 363 index FALS cases sequenced. Functional analysis revealed that ALS-related mutants were defective in forming alpha/beta tubulin dimers in vitro and in incorporating into microtubules in vivo. In addition, the truncated mutant TUBA4A p.W407X showed aggregation propensities. III) By sequencing the exomes of 32 SALS patients and their unaffected parents, we identified 25 de novo mutations (DNMs) in 16 of 32 trios, with an overall DNM rate of 0.78. Although we did not find recurrently mutated genes in our ALS trios, bionformatic analysis showed potential inter-connections between the candidate genes. Functional classification revealed that DNMs are enriched in genes encoding for proteins involved in transport and in GTPase regulatory activity. Conclusions: Our findings indicate that exome-sequencing, combined with different strategies for study design and data analysis, is an effective and successful approach for the identification of novel ALS causative genes. The identification of PFN1 and TUBA4A genes, encoding for proteins implicated, respectively, in actin polymerization and microtubule formation, further supports a major role of cytoskeletal defects in ALS pathogenesis.
Amyotrophic lateral sclerosis; neurodegenerative disease; exome-sequencing
Settore MED/26 - Neurologia
EXOME SEQUENCING APPROACH TO IDENTIFY CAUSATIVE GENES FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS / C. Tiloca ; tutore: G. P. Comi ; co-tutore: V. Silani ; coordinatore: M. Clerici. - : . DIPARTIMENTO DI FISIOPATOLOGIA MEDICO-CHIRURGICA E DEI TRAPIANTI, 2015 Jan 20. ((27. ciclo, Anno Accademico 2014. [10.13130/tiloca-cinzia_phd2015-01-20].
Doctoral Thesis
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