Identificazione di nuovi inibitori selettivi della proteina Rac1: possibili implicazioni farmacologiche

Le proteine Rho ad attività GTPasica appartenti alla superfamiglia Ras sono coinvolte nella regolazione di numerose funzioni cellulari associate a patologie cardiovascolari ed ai tumori. In particolare, numerose evidenze, sia in modelli sperimentali murini sia nell'uomo, suggeriscono come la proteina Rac1, facente parte della famiglia delle proteine Rho, sia coinvolta nella patogenesi dello scompenso cardiaco. Sulla base di queste evidenze, nel presente progetto, abbiamo voluto identificare e studiare nuovi potenziali inibitori farmacologici di Rac1. Per la loro identificazione abbiamo utilizato uno screening virtuale del database ZINC composto da circa sette milioni di composti. In questo screening si sono prese in considerazione le informazioni strutturali dell’interazione Rac1-GEF (fattori di scambio nucleotide guanina), la struttura chimica del composto NSC23766, inibitore specifico dell’interazione di Rac1 con i GEF, Tiam1 e Trio, e la struttura cristallografica di Rac1 complessata con il composto NSC23766. Quest’ultima è stata utilizzata per derivare un modello computazionale del recettore, da utilizzare per il docking molecolare. I composti che hanno mostrato energie di docking migliori rispetto a quelle ottenute per il composto NSC23766 (affinità < -4.2, London dG < -7.5, AD4 energia di legame < -6.4 kcal/mol) sono stati selezionati, per un totale di 106 molecole commercialmente disponibili. Dopo una analisi visiva delle pose di docking, sono stati selezionati 50 composti per la valutazione farmacologica. L'attività inibitoria di questi composti è stata valutata mediante saggio G-LISA per la determinazione del contenuto intracellulare di Rac1-GTP ad una concentrazione fissa di 50µM. Dei 50 composti saggiati 33 hanno mostrato un’attività inibitoria uguale o superiore al composto NSC23766, mentre 5 hanno mostrato una riduzione dei livelli intracellulari di Rac1-GTP, in risposta al PDGF-BB, superiori del 45%. In particolare tutti e 5 i composti hanno mostrato un effetto concentrazione dipendente con valori di IC50 compresi tra il 12.2 μM ed il 24.1 µM. I due composti più potenti hanno anche dimostrato di ridurre la formazione di lamellipodi in cellule 3T3, effetto mediato da Rac1, e di non inibire l’attività delle proteine omologhe a Rac1: RhoA e Cdc42. Infine, i composti selezionati, hanno mostrato di interferire con l’interazione delle proteine ricombinanti Rac1 e Tiam1 in vitro, effetto che potenzialmente alla base del loro meccanismo d’azione inibitorio sull’attivazione della proteina Rac1 intracellulare. In conclusione, questo studio ha permesso di identificare due nuove classi di composti ad attività inibitoria delle proteine Rac1, e permetterà in futuro di valutarne l’effetto sullo scompenso cardiaco in modelli animali sperimentali. Progetto EU 018671 CARDIOWORKBENCH