Valutazione comparativa dell’immunità aspecifica nei ruminanti di interesse zootecnico Saverio Paltrinieri, Stefano Comazzi, Paola Sartorelli Istituto di Patologia Generale Veterinaria Facoltà di Medicina Veterinaria, via Celoria 10 -Milano. Abstract – Evaluation of non-specific immunity in domestic ruminants. The different steps of phagocytosis of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in ruminants were examined using a specific panel of tests. PMNs were isolated by centrifugation and hypotonic lysis of erythrocytes from 60 ovine and 32 bovine blood samples. Zymosan activated serum (ZAS) was chemotactic in both the species, while human recombinant interleukin-8 (IL8) only for ovine PMNs. The uptake of latex particles was similar in the two species, with strong individual variability. Adherence of bovine PMNs increased after activation with phorbolmyristate acetate (PMA) but not after non-specific activation, that, in contrast, activated ovine PMNs. PMA increased superoxide production in both the species, with lower basal values in bovine, maybe due to the production of other reactive oxygen species. Key words : phagocytosis, chemotaxis, adherence, respiratory burst, ruminants 1. Introduzione Lo studio dell’attività dei granulociti neutrofili può essere utile per mettere in evidenza alterazioni del processo fagocitario responsabili della riduzione delle difese aspecifiche dell’organismo. In diverse condizioni patologiche o fisiopatologiche legate al periodo peri-partum dei ruminanti in produzione è segnalata una maggiore suscettibilità ad agenti infettivi anche a bassa patogenicità (Payne, 1977, Doho e Martin, 1984), giustificabili soprattutto con una minore efficienza delle difese immunitarie. Se da un lato sono state riscontrate alterazioni dell’immunità specifica (riduzione della blastogenesi linfocitaria, della produzione anticorpale o dell’attività citotossica linfocitaria) (Klucinski et al., 1988a, Franklin et al., 1991) le segnalazioni riguardanti l’attività fagocitaria dei polimorfonucleati neutrofili (PMN) sono relativamente rare e per lo più riguardanti specifici passaggi del processo fagocitario dei fagociti nel latte (Klucinski et al., 1988b) e solo raramente nel sangue (Guelfi e Courdouhji, 1987, Hoeben et al., 1997). Per i motivi sopraelencati appare opportuno verificare anche l’attività fagocitaria in PMN isolati direttamente dal sangue di ruminanti in produzione. Nel presente lavoro verranno riassunti e valutati sinotticamente i risultati ottenuti dal nostro gruppo di lavoro negli ultimi anni, durante i quali è stato messo a punto un pannello di test utile a valutare i diversi passaggi della fagocitosi nelle specie ovina e bovina. . 2. Materiali e Metodi Animali Sono stati analizzati complessivamente 60 campioni di sangue prelevati da altrettanti ovini di razza Bergamasca e Charolle, sani, stabulati presso la nostra facoltà, alimentati con fieno di prato stabile polifita, con aggiunta di mangime concentrato (0,5 Kg/die) ed acqua ad libitum, e 32 campioni di sangue prelevati da altrettante bovine frisone in fase di asciutta, provenienti da due diversi allevamenti di bovine lattifere della provincia di Milano, alimentate con unifeed. Ematologia In ogni prova sono stati prelevati 40 ml di sangue, utilizzando come anticoagulante 4 ml di soluzione contenente EDTA 1,5 g/dl, NaCl 0,7 g/dl, in tampone fosfato 0,0132 M, pH 7,2, per prevenire l’eventuale coagulazione. Sul sangue in toto sono stati effettuati i conteggi dei globuli rossi e dei globuli bianchi, nonché il valore ematocrito e la concentrazione di emoglobina mediante un analizzatore automatico (Hemat 8, SEAC); inoltre, su striscio colorato con il metodo May-Grunwald Giemsa è stata valutata la formula leucocitaria attraverso l’identificazione di almeno 200 cellule. Isolamento dei PMN I PMN sono stati isolati con il metodo di Carlson e Kaneko (1973); tutto il procedimento è stato condotto utilizzando provette in plastica per evitare l’adesione dei PMN alle pareti, che si verificherebbe utilizzando quelle in vetro. Il sangue è stato centrifugato a 1000g per 15 minuti ed il plasma è stato rimosso per aspirazione insieme al “buffy coat” ed allo strato eritrocitario immediatamente sottostante (circa 3 mm). La quota rimasta, che nei ruminanti è costituita dalla maggior parte dei PMN e dagli eritrociti, è stata sottoposta a lisi ipotonica con acqua distillata per 30 secondi e successivo ripristino dell’isotonicità per aggiunta di una soluzione ipertonica (NaCl 0,39 mol/l). Nella pecora la lisi osmotica è stata ripetuta una seconda volta in quanto, a differenza del bovino, un solo shock osmotico non è sufficiente per lisare completamente gli eritrociti (Buchta, 1990). Dopo due lavaggi in NaCl 0,7 mol/l in tampone fosfato 0,0132 M, pH 7,2 (PBS) a 200 g per 10 minuti, i PMN sono stati risospesi in1 ml di soluzione isotonica di Hanks (HBSS) e diluiti, previo conteggio dei globuli bianchi, alla concentrazione di 2 x 107 cellule/ml in HBSS. Su tale sospensione è stata determinata la formula leucocitaria, dopo centrifugazione di 0,1 ml di 2x106 cellule/ml in camera di sedimentazione (Neuroprobe) a 50 g x 5 min, e successiva colorazione con il metodo May-Grunwald Giemsa. E’ stata inoltre valutata la percentuale di cellule vive, utilizzando il metodo di esclusione del Trypan blu (Metcalf et al., 1986). Prove funzionali sui granulociti isolati Chemiotassi La valutazione della chemiotassi è stata effettuata su 40 campioni di sangue ovino e su 32 campioni di sangue bovino, utilizzando camere di Boyden modificate costituite da 12 pozzetti, ognuno dei quali suddiviso in due compartimenti tra i quali viene interposto un filtro di nitrato di cellulosa (spessore di 150  e pori del diametro di 3 . I pozzetti inferiori sono stati riempiti con: a) soluzione di HBSS con HEPES (20 mmol/l) e albumina (10 mg/ml) (HEA, controllo); b) siero omologo attivato con Zymosan (ZAS) diluito al 50% in HEA (ZAS); lo ZAS è stato ottenuto incubando a 37°C per 30 minuti un pool di sieri freschi di ovino o di bovino in presenza di 10 mg/ml di zymosan e prelevando il surnatante dopo centrifugazione a 500 g per 5 minuti (Gray et al.,1982); c) una soluzione di interleuchina-8 (IL-8) ricombinante umana (Peprotech) diluita in HEA alla concentrazione finale di 25 ng/ml; l'azione dell' IL-8 è stata saggiata su 20 campioni di sangue ovino e 18 di sangue bovino. Nei pozzetti superiori sono state poste le cellule alla concentrazione di 2x106/ml, diluite in HEA. Ogni esame è stato eseguito in doppio. La camera è stata quindi posta ad incubare in camera umida a 37° (5% CO2) per 60 minuti. Al termine dell’incubazione il filtro è stato rimosso, fissato in alcool 70°, idratato e colorato in emallume di Mayer per 1 minuto; dopo passaggio in una serie crescente di alcool (70°, 95°, assoluto) e chiarificazione in xilolo, le parti del filtro corrispondenti ai pozzetti sono state tagliate e montate su vetrino. La migrazione cellulare è stata valutata secondo il metodo del “leading front” (Zigmond e Hirsch, 1973): sono stati valutati 20 campi microscopici a 250 ingrandimenti all’interno di ogni filtro, variando il piano focale mediante la vite micrometrica, e calcolando la differenza, in micron, tra il piano focale in cui era visibile a fuoco il maggior numero di cellule (piano di partenza) e quello in cui si vedevano a fuoco le due cellule più lontane (fronte migrante). La media delle venti osservazioni ottenuta da due diversi osservatori è stata utilizzata come indice della motilità del campione in esame. Fagocitosi La capacità di inglobamento è stata valutata in 60 campioni di sangue ovino e in 17 campioni di sangue bovino, utilizzando particelle latice di polistirene (diametro: 1,09 µm) preventivamente dializzate contro acqua distillata per quattro giorni e diluite in soluzione fisiologica alla concentrazione finale di 2 x 109 particelle/ml. Per la stimolazione della fagocitosi si è impiegato un rapporto cellule/particelle di 1/20 (Tater et al., 1987). Dopo preincubazione della sospensione di latice di polistirene, diluita in HBSS, a 37°C per dieci minuti, è stata aggiunta la sospensione di PMN (2 x 107 cellule/ml) ed i campioni così ottenuti sono stati incubati in termostato a 37°C per 60 minuti. Al termine dell’incubazione la fagocitosi è stata bloccata per aggiunta di una soluzione contenente EDTA 1,5 g/dl in PBS g/dl e sono stati effettuati 2 lavaggi per allontanare le particelle di latice non fagocitate. Al termine il sedimento è stato risospeso in 2 ml di diossano e i campioni sono stati posti ad incubare a 23°C per 20 ore (Kvarstein,1969). Dopo centrifugazio0ne (2400 g per 10 min) sul sovranatante è stata valutata la quantità di latice ingerito mediante lettura spettrofotometrica a 255,5 nm contro diossano. Dosaggio simultaneo di aderenza e produzione di anione superossido La sospensione cellulare, ottenuta dopo isolamento, è stata diluita in HBSS addizionata di albumina allo 0,2% alla concentrazione finale di 2 x 106 cellule/ml. Per l'esecuzione delle prove, effettuate su 32 campioni di sangue ovino e 13 campioni di sangue bovino, è stata utilizzata una metodica in micropiastre a 96 pozzetti (Bellavite et al., 1992), con alcune modifichei (Sartorelli et al., 1999b). Dal momento che l'incubazione a contatto con la plastica potrebbe essere sufficiente ad attivare i PMN, precludendo una valutazione dei valori basali, nonchè dell'eventuale effetto di sostanze stimolanti, è stata effettuata una preincubazione dei pozzetti con gelatina (5mg/ml PBS) per 60 minuti a 4°C, seguita da due lavaggi in PBS. Questa procedura è stata, invece, omessa per valutare l’eventuale effetto stimolante del contatto con la plastica. Nei pozzetti sono stati posti 100 l di sospensione cellulare e la piastra è stata incubata per 10 minuti in incubatore a CO2 (5%) a 37°C. Per la valutazione della produzione di anione superossido sono stati aggiunti 50 l di citocromo C (Sigma) alla concentrazione di 0.054 mmol/l inHBSS. Il forbol-miristato acetato (PMA) è stato aggiunto alla concentrazione finale di 10-7 mol/l nei pozzetti destinati alla valutazione dell'effetto di tale composto. Ogni prova è stata effettuata in quadruplo. Per verificare che l'anione superossido valutato fosse la quota inibibile dalla superossido dismutasi (SOD), è stato allestito come bianco un pozzetto contenente, oltre alla sospensione cellulare ed al citocromo C, anche 700 U di SOD. Al tempo 0 e dopo 40 minuti di incubazione a 37°C in incubatore al 5% di CO2, è stata valutata la densità ottica a 550 nm e, come lunghezza d'onda di riferimento, a 670 nm in lettore di piastre Multiskan (Labsystem). Le nanomoli di superossido prodotte in 40 minuti sono state calcolate usando la formula proposta da Albertine e Gee (1996): nmol O2- = [(OD550-OD670) x 100]/6,3 Al termine dell’ incubazione è stata valutata l'aderenza (Bellavite et al., 1992): le piastre sono state lavate 2 volte con PBS a temperatura ambiente, per eliminare le cellule non adese, ed in ogni pozzetto sono stati posti 75 l di tampone acetato 0,15 mol/l, pH 5,3, contenente 0,2% di Triton X-100. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, per lisare le cellule aderenti e consentire la liberazione nel mezzo della fosfatasi acida intracellulare, sono stati aggiunti 75 l di tampone acetato 0,1 mol/l, pH 5,3, contenente p-nitrofenilfosfato 10 mmol/l. Dopo 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente, la reazione è stata bloccata per aggiunta di 100 l di NaOH 2N e la densita' ottica dei singoli pozzetti contro bianco è stata determinata a 405 nm in lettore di piastre Multiskan. Analisi statistica L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando uno specifico software (Statistica 5.1, Statsoft. Inc). I risultati ottenuti nell’ovino sono stati confrontati con quelli ottenuti nel bovino mediante test t di Student o, nel caso di dati con distribuzione non normale, mediante il corrispondente test non parametrico di U-Mann Whitney. In ognuna delle due specie in esame, i risultati ottenuti dopo attivazione nelle prove di chemiotassi, aderenza e produzione di anione superossido sono stati paragonati con quelli basali mediante ANOVA per misure ripetute, e le differenze tra i gruppi sono state misurate mediante LSD test. 3. Risultati Ematologia I risultati degli esami ematologici non hanno evidenziato valori al di fuori dei range di normalità per le specie esaminate (Jain, 1993). Isolamento dei PMN Le popolazioni cellulari isolate nel bovino e nella pecora (Tab. 1) sono risultate sostanzialmente sovrapponibili, per quanto riguarda la vitalità cellulare La percentuale di granulociti neutrofili presente nelle popolazioni isolate dal bovino è risultata significativamente superiore a quella rilevata nel bovino, che, peraltro, presentava una percentuale significativamente inferiore di granulociti eosinofili. In entrambe le specie, infatti, si è osservata una discreta contaminazione da parte di granulociti eosinofili e cellule mononucleate (linfociti e monociti) ed una correlazione positiva tra il numero di PMN nel sangue e quello dei PMN isolati (P<0,001; r=0,66 per la pecora; r=0,74 per il bovino). La percentuale di recupero dei neutrofili rispetto a quelli di partenza, infine è risultata significativamente più elevata nel bovino. Tabella 1. Valori medi (± D.S.) relativi a vitalità, purezza e recupero delle popolazioni cellulari isolate dal sangue di pecora e di bovino Vitalità % Purezza % Recupero % granulociti neutrofili granulociti eosinofili cellule mononucleate Ovino 96,9 ± 1,4 68,5 ± 13,4 17,1 ± 12,2 14,5 ± 10,3 34,8 ± 16,7 Bovino 97,3 ± 0,8 74,6 ± 13,3 9,1 ± 9,4 16,3 ± 11,5 47,2 ± 22 n.s. * *** n.s. ** Aderenza Per quanto riguarda l’aderenza (tabella 3) la variabilità tra soggetti risulta molto elevata. Tabella 3. Valori medi (± D.S.) relativi all’aderenza rilevata nel bovino e nella pecora (D.O. x 1.000) in condizioni basali e dopo attivazione ottenuta per contatto con la plastica (Aspecifica), per aggiunta di forbolmiristato acetato (PMA, Specifica) o mediante entrambi i metodi (Mista) Basale Aspecifica Specifica Mista ANOVA LSD Ovino 112,9 ± 124,7 185,9 ± 157,1 258,1 ± 141,5 246,2 ± 137,6 *** ** Asp vs Bas; *** Sp e Misto vs Bas; ** Sp vs Asp; * Misto vs Asp Bovino 95,9 ± 123,3 173,4 ± 164,4 213,5 ± 146,8 216,2 ± 144,9 * * Sp e Misto vs Bas ns ns ns ns Il semplice contatto con la plastica è in grado di indurre un significativo aumento dell’aderenza solo nella specie ovina. L’aggiunta del PMA 10-7 mol/l, attiva l’aderenza dei PMNs bovini ed induce un ulteriore aumento di aderenza nella specie ovina. La doppia stimolazione, aspecifica e con PMA, non esercita, invece, effetti additivi in nessuna delle due specie esaminate. Chemiotassi I valori relativi alla motilità spontanea e dopo stimolazione con ZAS e IL-8 sono riportati in Tab 2 Tabella 2. Valori medi (± D.S.) relativi alla motilità spontanea (espressa in µm) ed a quella rilevabile dopo attivazione con siero omologo attivato con Zymosan (ZAS) o con interleuchina-8 ricombinante umana (IL-8) nel bovino e nella pecora C ZAS IL8 C vs ZAS ANOVA LSD test Ovino 79,7 ±25,0 98,4 ± 21,5 105,8 ± 32,3 *** *** *** ZAS e IL8 vs C Bovino 27,3 ± 16,9 75,6 ± 43,9 16,0 ± 6,4 *** *** *** ZAS vs C e IL8 *** * *** La motilità spontanea è risultata significativamente maggiore nella pecora. La stimolazione con ZAS e IL-8 induce nella pecora un aumento significativo e sovrapponibile della distanza percorsa dai PMN. Nel bovino solo lo ZAS è in grado di stimolare la chemiotassi mentre la IL-8 risulta inattiva. Anche la chemiotassi indotta da ZAS risulta comunque superiore nella pecora rispetto al bovino. Inglobamento di particelle I risultati ottenuti sono riportati in tabella 4. Tabella 4. Valori medi (± D.S.) relativi alla capacità di inglobamento di particelle di latice (D.O. x 1.000) rilevata nel bovino e nella pecora inglobamento Ovino 263,6 ± 247,1 Bovino 241,0 ± 242,6 n.s. Questo parametro presenta, sia nel bovino che nell’ovino, una elevata variabilità individuale, che rende non significativo un confronto quantitativo tra le due specie. Produzione di anione superossido (SO) La produzione di SO (tabella 5) in condizioni basali appare molto scarsa in entrambe le specie. Tabella 5. Valori medi (± D.S.) relativi alle nanomoli di anione superossido prodotte in 40 minuti nel bovino e nella pecora (D.O. x 1.000) in condizioni basali e dopo attivazione ottenuta per contatto con la plastica (Aspecifica), per aggiunta di forbolmiristato acetato (PMA, Specifica) o mediante entrambi i metodi (Mista) Basale Aspecifica Specifica Mista ANOVA LSD test Ovino 0,17 ± 0,17 0,31 ± 0,27 2,32 ± 0,91 2,32 ± 0,80 *** *** Sp e Misto vs Bas e Asp Bovino 0,22 ± 0,25 0,04 ± 0,20 2,07 ± 0,49 2,28 ± 0,57 *** *** Sp e Misto vs Bas e Asp ns *** * ns Nel bovino, come nell’ovino, il contatto con la plastica non stimola la liberazione di SO, mentre tutte due le specie risultano sensibili all’azione del PMA alla concentrazione di 10-7 mol/l. La stimolazione mista, plastica e PMA, non causa un ulteriore incremento nella produzione di SO. Il comportamento dei pozzetti contenenti SOD (bianco) risulta differente nelle due specie. Nella pecora l’aggiunta di SOD, che inibisce la produzione di SO, riduce praticamente a zero il valore di assorbanza rispetto al bianco acellulare contenente i soli reagenti. Nel bovino invece i valori del bianco contenente SOD tendono progressivamente a diminuire rispetto al bianco acellulare, in maniera più spiccata dopo stimolazione con PMA. 4. Conclusioni Il corretto funzionamento delle difese aspecifiche è fondamentale per garantire lo stato di salute, e quindi il benessere dell’animale, attraverso la pronta eliminazione dei microrganismi diffusi nell’ambiente. Tutte le tappe del processo fagocitario sono ugualmente importanti, come dimostrato dalla compromissione anche di una sola di queste attività, che si verifica ad esempio nel caso di malattie ereditarie riguardanti le capacità adesive dei PMN (Leukocyte Adhesion Deficiency), segnalate nel bovino (Kehrli et al., 1992) e nel cane (Giger et al. 1987; Trowald-Wigh et al., 1999), la chemiotassi (Gallin et al., 1980) o la risposta ossidativa (malattia granulomatosa cronica) (Zinkl e Kabbur, 1997). Nel corso della vita produttiva dei ruminanti sono segnalate alterazioni acquisite delle difese aspecifiche in particolari momenti fisiopatologici (peri-partum, stress, ecc) (Henricks et al., 1987, Saad et al., 1989), e a seguito di patologie metaboliche quali la chetosi (Kuzma et al., 1997) per la presenza in circolo di sostanze a probabile azione immunosoppressiva (Dosogne et al., 1999; Sartorelli et al., 1999a; Sartorelli et al., 1999b). Le indagini comparate risultano indispensabili per acquisire conoscenze relative alle differenze di specie, per quanto riguarda sia l’entità della risposta, sia la sensibilità a sostanze stimolanti che possono condizionare le risposte funzionali. E’ quindi importante disporre di metodiche che consentono di effettuare uno screening completo delle diverse attività funzionali dei PMN, applicabile a specie differenti. Il metodo da noi impiegato per l’isolamento dei PMN è frequentemente utilizzato nei ruminanti e permette di ottenere una popolazione cellulare adeguata, sia dal punto di vista qualitativo, in termini di rappresentatività della popolazione di partenza, di purezza e di vitalità, sia dal punto di vista quantitativo, essendo il numero di cellule recuperate sufficiente all’espletamento dell’intero pannello di test funzionali, partendo da una quantità di sangue (40 ml) che è possibile ottenere senza problemi anche da un piccolo ruminante. La presenza di cellule (eosinofili, cellule mononucleate), che potrebbero interferire con le prove effettuate, risulta contenuta, anche se non è possibile escludere una influenza indiretta, tramite la produzione di citochine, in particolare da parte di linfociti e monociti (Mulder and Colditz, 1993; Salak et al., 1993). Le popolazioni cellulari ottenute dalla pecora e dal bovino risultano comunque sovrapponibili e di conseguenza i risultati delle diverse prove funzionali sono correttamente comparabili. Le piccole differenze di purezza e recupero appaiono imputabili al fatto che il metodo non consente di concentrare i PMN, come indicato dalla correlazione significativa tra il numero di PMN nel sangue e quelli isolati, e di conseguenza la maggior presenza di eosinofili nel sangue ovino si ripercuote anche sulla popolazione cellulare isolata. E’ da sottolineare comunque che nessuno degli animali impiegati nel presente lavoro presentava alterazioni del quadro ematologico. La capacità di aderire all’endotelio, condizionando la capacità dei PMN di fuoriuscire dai vasi nel corso del processo infiammatorio, rappresenta la prima tappa del processo fagocitario, e la sua importanza è testimoniata dalla particolare gravità assunta da infezioni batteriche, peraltro comuni, in soggetti di specie diverse (uomo, bovino, cane) che presentano deficit su base genetica di questa attività (Kehrli et al., 1992; Giger et al., 1987; Trowald-Wigh et al., 1999). L’aderenza risulta quantitativamente sovrapponibile nel bovino e nell’ovino, anche se questo parametro presenta in ogni caso notevoli variazioni individuali, in parte responsabili dell’assenza di significatività statistica. Il contatto con superfici elettronegative come la plastica (ed in vitro la membrana basale e il collagene), è in grado, in particolare nella pecora, di attivare la capacità adesiva dei PMN, anche se in maniera minore rispetto a sostanze, quali il PMA, che in vivo sono prodotte da agenti infettivi e che stimolano efficacemente sia i PMN ovini che quelli bovini. Nel bovino è stata evidenziata l’espressione della molecola di adesione CD-18 dopo stimolazione con PMA (Nagahata et al., 1995), mentre non sono disponibili segnalazioni circa l’effetto del contatto con la plastica. Il PMA sembra determinare una risposta massimale, dato che la stimolazione combinata, plastica-PMA, non determina ulteriori incrementi dell’aderenza. La tappa successiva, la chemiotassi, presenta invece differenze tra le due specie, sia quantitative che qualitative. La motilità spontanea risulta significativamente inferiore nel bovino rispetto alla pecora. Questo non sembra imputabile ad uno stato di pre-attivazione dei PMN ovini (in vivo o a seguito delle manipolazioni in vitro), in quanto i valori relativi ad altre attività funzionali (ad es. la produzione di SO) rientrano nei livelli segnalati per PMN ovini a riposo (Albertine e Gee, 1996). Anche dopo stimolazione con ZAS, in cui sono presenti fattori chemiotattici derivati dall’attivazione del complemento, la distanza percorsa dai PMN ovini risulta superiore. Lo ZAS si conferma comunque una sostanza in grado di stimolare i movimenti direzionali nei PMN dei ruminanti (Mulder e Colditz, 1993; Paltrinieri et al., 1996), che, come quelli di altri ungulati, sono insensibili al peptide chemiotattico formyl-metionyl-leucyl-phenylalanine (f-MLP), impiegato per quelli umani (Gray et al., 1982). I PMN bovini invece, a differenza di quelli ovini appaiono scarsamente sensibili all’IL-8, citochina ad azione chemiotattica attiva in numerose specie. La elevata omologia (96%) tra la sequenza aminoacidica dell’ IL-8 ovina e bovina (Caswell et al. 1999) induce a ritenere tale risultato imputabile ad una minore espressione del recettore specifico o a differenze nel pattern postrecettoriale nella specie bovina piuttosto che a sostanziali differenze di struttura tra i recettori delle due specie. La capacità di inglobamento di particelle di latice, non richiedendo l’impiego di opsonine (Karnovsky e Bolis, 1992), è indicativa dell’attività di ingestione “basale”, indipendente dalla presenza di recettori e dalla compartecipazione del sistema immunitario specifico. Questa attività funzionale risulta sovrapponibile tra le due specie indagate; va sottolineato tuttavia che anche in soggetti sani questo parametro presenta comunque una elevata variabilità individuale, peraltro già segnalata (Paape e Pearson, 1979). La produzione di SO è una misura della capacità battericida dei PMN, esplicata tramite la liberazione di composti attivi dell’ossigeno (Respiratory burst). E’ quindi la tappa finale del processo fagocitario, che ha come risultato quello di uccidere e degradare l’agente infettivo. I composti attivi dell’ossigeno possono essere diversi (SO, perossido di idrogeno, ossigeno singoletto, acido ipocloroso ecc); la metodica impiegata (Bellavite et al., 1992) prevede il dosaggio della quota di SO che è inibita dalla SOD, quindi quella prodotta dalla attivazione della NADPH ossidasi di membrana. La differenza di comportamento del bianco contenente SOD induce a ritenere che i composti dell’ossigeno prodotti nelle due specie siano quali-quantitativamente differenti. La ri-ossidazione del citocromo C, risultante in una progressiva riduzione dei valori di D.O., evidente nel bovino già in condizioni basali, e stimolata dal PMA, fa supporre che in questa specie, più che nella pecora, venga prodotto accanto al SO un composto ad azione ossidante, come ad esempio il perossido di idrogeno (Metcalf et al., 1986). Ciò potrebbe portare ad una sottostima dei valori di SO prodotto, e giustificare in parte la differenza quantitativa emerso tra SO prodotto dai PMN bovini e ovini. In condizioni basali il SO prodotto è comunque molto scarso, a conferma che le manualità operative a cui sono sottoposti i PMN durante la purificazione in vitro non ne determina una sostanziale attivazione (Albertine e Gee, 1996). Contrariamente a quanto accade per l’aderenza, il contatto con la plastica non incrementa la produzione di SO in queste due specie. La possibilità di una dissociazione tra le due risposte è già stata segnalata nell’uomo (Bellavite et al., 1992). Il PMA 10-7 mol/l è in grado di stimolare, attraverso l’intervento di una proteina chinasi C (Dore et al., 1992), la produzione di SO sia nel bovino che nella pecora, anche se questa risulta più lenta e quantitativamente inferiore a quella dei PMN umani (Bellavite et al., 1992) in accordo con quanto riportato da altri Autori (Albertine e Gee, 1996; Heyneman et al., 1990) viene quindi confermata la scarsa capacità ossidativa dei PMN dei ruminanti (Guelfi e Courdohouhji, 1987; Buchta, 1990). La doppia stimolazione, plastica e PMA, non induce, come per l'aderenza, un ulteriore incremento del SO prodotto In conclusione, il pannello di test da noi messo a punto per i ruminanti consente di effettuare sullo stesso animale una valutazione pressoché completa dell’intero processo di fagocitosi, esplorandone le diverse tappe funzionali. L’individuazione di difetti del processo fagocitario in situazioni di particolare suscettibilità alle malattie infettive consentirebbe di attivare le necessarie misure di prevenzione a tutela della salute dell’animale. Ringraziamenti- Ricerca effettuata con contributo M.U.R.S.T. ex-40% e 60% Bibliografia Albertine K. H., Gee M.H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J. Leukoc. Biol. 1996, 59; 631-638. Bellavite P., Chirumbolo S., Mansoldo C., Gandini G., Dri P. Simultaneous assay for oxidative methabolism and adhesion of human neutrophils: evidence for correlations and dissociations of the two responses. J. Leukoc. Biol. 1992; 51,329-335. Buchta, R. Functional and biochemical properties of ovine neutrophils. Vet. Immunol. Immunopathol. 1990; 24, 97- 112. Carlson G.P., Kaneko J.J. Isolation of leukocytes from bovine peripheral blood. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1973; 142, 853-856. Caswell J.L., Middleton D.M., Gordon J.R. 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Valutazione comparativa dell’immunità aspecifica nei ruminanti di interesse zootecnico / S. Paltrinieri, S. Comazzi, P. Sartorelli. ((Intervento presentato al 34. convegno 34° simposio internazionale di zootecnia. Workshop: strumenti innovativi per la ricerca avanzata nelle produzioni animali tenutosi a Milano nel 1999.

Valutazione comparativa dell’immunità aspecifica nei ruminanti di interesse zootecnico.

S. Paltrinieri
Primo
;
S. Comazzi
Secondo
;
P. Sartorelli
Ultimo
1999

Abstract

Valutazione comparativa dell’immunità aspecifica nei ruminanti di interesse zootecnico Saverio Paltrinieri, Stefano Comazzi, Paola Sartorelli Istituto di Patologia Generale Veterinaria Facoltà di Medicina Veterinaria, via Celoria 10 -Milano. Abstract – Evaluation of non-specific immunity in domestic ruminants. The different steps of phagocytosis of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in ruminants were examined using a specific panel of tests. PMNs were isolated by centrifugation and hypotonic lysis of erythrocytes from 60 ovine and 32 bovine blood samples. Zymosan activated serum (ZAS) was chemotactic in both the species, while human recombinant interleukin-8 (IL8) only for ovine PMNs. The uptake of latex particles was similar in the two species, with strong individual variability. Adherence of bovine PMNs increased after activation with phorbolmyristate acetate (PMA) but not after non-specific activation, that, in contrast, activated ovine PMNs. PMA increased superoxide production in both the species, with lower basal values in bovine, maybe due to the production of other reactive oxygen species. Key words : phagocytosis, chemotaxis, adherence, respiratory burst, ruminants 1. Introduzione Lo studio dell’attività dei granulociti neutrofili può essere utile per mettere in evidenza alterazioni del processo fagocitario responsabili della riduzione delle difese aspecifiche dell’organismo. In diverse condizioni patologiche o fisiopatologiche legate al periodo peri-partum dei ruminanti in produzione è segnalata una maggiore suscettibilità ad agenti infettivi anche a bassa patogenicità (Payne, 1977, Doho e Martin, 1984), giustificabili soprattutto con una minore efficienza delle difese immunitarie. Se da un lato sono state riscontrate alterazioni dell’immunità specifica (riduzione della blastogenesi linfocitaria, della produzione anticorpale o dell’attività citotossica linfocitaria) (Klucinski et al., 1988a, Franklin et al., 1991) le segnalazioni riguardanti l’attività fagocitaria dei polimorfonucleati neutrofili (PMN) sono relativamente rare e per lo più riguardanti specifici passaggi del processo fagocitario dei fagociti nel latte (Klucinski et al., 1988b) e solo raramente nel sangue (Guelfi e Courdouhji, 1987, Hoeben et al., 1997). Per i motivi sopraelencati appare opportuno verificare anche l’attività fagocitaria in PMN isolati direttamente dal sangue di ruminanti in produzione. Nel presente lavoro verranno riassunti e valutati sinotticamente i risultati ottenuti dal nostro gruppo di lavoro negli ultimi anni, durante i quali è stato messo a punto un pannello di test utile a valutare i diversi passaggi della fagocitosi nelle specie ovina e bovina. . 2. Materiali e Metodi Animali Sono stati analizzati complessivamente 60 campioni di sangue prelevati da altrettanti ovini di razza Bergamasca e Charolle, sani, stabulati presso la nostra facoltà, alimentati con fieno di prato stabile polifita, con aggiunta di mangime concentrato (0,5 Kg/die) ed acqua ad libitum, e 32 campioni di sangue prelevati da altrettante bovine frisone in fase di asciutta, provenienti da due diversi allevamenti di bovine lattifere della provincia di Milano, alimentate con unifeed. Ematologia In ogni prova sono stati prelevati 40 ml di sangue, utilizzando come anticoagulante 4 ml di soluzione contenente EDTA 1,5 g/dl, NaCl 0,7 g/dl, in tampone fosfato 0,0132 M, pH 7,2, per prevenire l’eventuale coagulazione. Sul sangue in toto sono stati effettuati i conteggi dei globuli rossi e dei globuli bianchi, nonché il valore ematocrito e la concentrazione di emoglobina mediante un analizzatore automatico (Hemat 8, SEAC); inoltre, su striscio colorato con il metodo May-Grunwald Giemsa è stata valutata la formula leucocitaria attraverso l’identificazione di almeno 200 cellule. Isolamento dei PMN I PMN sono stati isolati con il metodo di Carlson e Kaneko (1973); tutto il procedimento è stato condotto utilizzando provette in plastica per evitare l’adesione dei PMN alle pareti, che si verificherebbe utilizzando quelle in vetro. Il sangue è stato centrifugato a 1000g per 15 minuti ed il plasma è stato rimosso per aspirazione insieme al “buffy coat” ed allo strato eritrocitario immediatamente sottostante (circa 3 mm). La quota rimasta, che nei ruminanti è costituita dalla maggior parte dei PMN e dagli eritrociti, è stata sottoposta a lisi ipotonica con acqua distillata per 30 secondi e successivo ripristino dell’isotonicità per aggiunta di una soluzione ipertonica (NaCl 0,39 mol/l). Nella pecora la lisi osmotica è stata ripetuta una seconda volta in quanto, a differenza del bovino, un solo shock osmotico non è sufficiente per lisare completamente gli eritrociti (Buchta, 1990). Dopo due lavaggi in NaCl 0,7 mol/l in tampone fosfato 0,0132 M, pH 7,2 (PBS) a 200 g per 10 minuti, i PMN sono stati risospesi in1 ml di soluzione isotonica di Hanks (HBSS) e diluiti, previo conteggio dei globuli bianchi, alla concentrazione di 2 x 107 cellule/ml in HBSS. Su tale sospensione è stata determinata la formula leucocitaria, dopo centrifugazione di 0,1 ml di 2x106 cellule/ml in camera di sedimentazione (Neuroprobe) a 50 g x 5 min, e successiva colorazione con il metodo May-Grunwald Giemsa. E’ stata inoltre valutata la percentuale di cellule vive, utilizzando il metodo di esclusione del Trypan blu (Metcalf et al., 1986). Prove funzionali sui granulociti isolati Chemiotassi La valutazione della chemiotassi è stata effettuata su 40 campioni di sangue ovino e su 32 campioni di sangue bovino, utilizzando camere di Boyden modificate costituite da 12 pozzetti, ognuno dei quali suddiviso in due compartimenti tra i quali viene interposto un filtro di nitrato di cellulosa (spessore di 150  e pori del diametro di 3 . I pozzetti inferiori sono stati riempiti con: a) soluzione di HBSS con HEPES (20 mmol/l) e albumina (10 mg/ml) (HEA, controllo); b) siero omologo attivato con Zymosan (ZAS) diluito al 50% in HEA (ZAS); lo ZAS è stato ottenuto incubando a 37°C per 30 minuti un pool di sieri freschi di ovino o di bovino in presenza di 10 mg/ml di zymosan e prelevando il surnatante dopo centrifugazione a 500 g per 5 minuti (Gray et al.,1982); c) una soluzione di interleuchina-8 (IL-8) ricombinante umana (Peprotech) diluita in HEA alla concentrazione finale di 25 ng/ml; l'azione dell' IL-8 è stata saggiata su 20 campioni di sangue ovino e 18 di sangue bovino. Nei pozzetti superiori sono state poste le cellule alla concentrazione di 2x106/ml, diluite in HEA. Ogni esame è stato eseguito in doppio. La camera è stata quindi posta ad incubare in camera umida a 37° (5% CO2) per 60 minuti. Al termine dell’incubazione il filtro è stato rimosso, fissato in alcool 70°, idratato e colorato in emallume di Mayer per 1 minuto; dopo passaggio in una serie crescente di alcool (70°, 95°, assoluto) e chiarificazione in xilolo, le parti del filtro corrispondenti ai pozzetti sono state tagliate e montate su vetrino. La migrazione cellulare è stata valutata secondo il metodo del “leading front” (Zigmond e Hirsch, 1973): sono stati valutati 20 campi microscopici a 250 ingrandimenti all’interno di ogni filtro, variando il piano focale mediante la vite micrometrica, e calcolando la differenza, in micron, tra il piano focale in cui era visibile a fuoco il maggior numero di cellule (piano di partenza) e quello in cui si vedevano a fuoco le due cellule più lontane (fronte migrante). La media delle venti osservazioni ottenuta da due diversi osservatori è stata utilizzata come indice della motilità del campione in esame. Fagocitosi La capacità di inglobamento è stata valutata in 60 campioni di sangue ovino e in 17 campioni di sangue bovino, utilizzando particelle latice di polistirene (diametro: 1,09 µm) preventivamente dializzate contro acqua distillata per quattro giorni e diluite in soluzione fisiologica alla concentrazione finale di 2 x 109 particelle/ml. Per la stimolazione della fagocitosi si è impiegato un rapporto cellule/particelle di 1/20 (Tater et al., 1987). Dopo preincubazione della sospensione di latice di polistirene, diluita in HBSS, a 37°C per dieci minuti, è stata aggiunta la sospensione di PMN (2 x 107 cellule/ml) ed i campioni così ottenuti sono stati incubati in termostato a 37°C per 60 minuti. Al termine dell’incubazione la fagocitosi è stata bloccata per aggiunta di una soluzione contenente EDTA 1,5 g/dl in PBS g/dl e sono stati effettuati 2 lavaggi per allontanare le particelle di latice non fagocitate. Al termine il sedimento è stato risospeso in 2 ml di diossano e i campioni sono stati posti ad incubare a 23°C per 20 ore (Kvarstein,1969). Dopo centrifugazio0ne (2400 g per 10 min) sul sovranatante è stata valutata la quantità di latice ingerito mediante lettura spettrofotometrica a 255,5 nm contro diossano. Dosaggio simultaneo di aderenza e produzione di anione superossido La sospensione cellulare, ottenuta dopo isolamento, è stata diluita in HBSS addizionata di albumina allo 0,2% alla concentrazione finale di 2 x 106 cellule/ml. Per l'esecuzione delle prove, effettuate su 32 campioni di sangue ovino e 13 campioni di sangue bovino, è stata utilizzata una metodica in micropiastre a 96 pozzetti (Bellavite et al., 1992), con alcune modifichei (Sartorelli et al., 1999b). Dal momento che l'incubazione a contatto con la plastica potrebbe essere sufficiente ad attivare i PMN, precludendo una valutazione dei valori basali, nonchè dell'eventuale effetto di sostanze stimolanti, è stata effettuata una preincubazione dei pozzetti con gelatina (5mg/ml PBS) per 60 minuti a 4°C, seguita da due lavaggi in PBS. Questa procedura è stata, invece, omessa per valutare l’eventuale effetto stimolante del contatto con la plastica. Nei pozzetti sono stati posti 100 l di sospensione cellulare e la piastra è stata incubata per 10 minuti in incubatore a CO2 (5%) a 37°C. Per la valutazione della produzione di anione superossido sono stati aggiunti 50 l di citocromo C (Sigma) alla concentrazione di 0.054 mmol/l inHBSS. Il forbol-miristato acetato (PMA) è stato aggiunto alla concentrazione finale di 10-7 mol/l nei pozzetti destinati alla valutazione dell'effetto di tale composto. Ogni prova è stata effettuata in quadruplo. Per verificare che l'anione superossido valutato fosse la quota inibibile dalla superossido dismutasi (SOD), è stato allestito come bianco un pozzetto contenente, oltre alla sospensione cellulare ed al citocromo C, anche 700 U di SOD. Al tempo 0 e dopo 40 minuti di incubazione a 37°C in incubatore al 5% di CO2, è stata valutata la densità ottica a 550 nm e, come lunghezza d'onda di riferimento, a 670 nm in lettore di piastre Multiskan (Labsystem). Le nanomoli di superossido prodotte in 40 minuti sono state calcolate usando la formula proposta da Albertine e Gee (1996): nmol O2- = [(OD550-OD670) x 100]/6,3 Al termine dell’ incubazione è stata valutata l'aderenza (Bellavite et al., 1992): le piastre sono state lavate 2 volte con PBS a temperatura ambiente, per eliminare le cellule non adese, ed in ogni pozzetto sono stati posti 75 l di tampone acetato 0,15 mol/l, pH 5,3, contenente 0,2% di Triton X-100. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, per lisare le cellule aderenti e consentire la liberazione nel mezzo della fosfatasi acida intracellulare, sono stati aggiunti 75 l di tampone acetato 0,1 mol/l, pH 5,3, contenente p-nitrofenilfosfato 10 mmol/l. Dopo 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente, la reazione è stata bloccata per aggiunta di 100 l di NaOH 2N e la densita' ottica dei singoli pozzetti contro bianco è stata determinata a 405 nm in lettore di piastre Multiskan. Analisi statistica L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando uno specifico software (Statistica 5.1, Statsoft. Inc). I risultati ottenuti nell’ovino sono stati confrontati con quelli ottenuti nel bovino mediante test t di Student o, nel caso di dati con distribuzione non normale, mediante il corrispondente test non parametrico di U-Mann Whitney. In ognuna delle due specie in esame, i risultati ottenuti dopo attivazione nelle prove di chemiotassi, aderenza e produzione di anione superossido sono stati paragonati con quelli basali mediante ANOVA per misure ripetute, e le differenze tra i gruppi sono state misurate mediante LSD test. 3. Risultati Ematologia I risultati degli esami ematologici non hanno evidenziato valori al di fuori dei range di normalità per le specie esaminate (Jain, 1993). Isolamento dei PMN Le popolazioni cellulari isolate nel bovino e nella pecora (Tab. 1) sono risultate sostanzialmente sovrapponibili, per quanto riguarda la vitalità cellulare La percentuale di granulociti neutrofili presente nelle popolazioni isolate dal bovino è risultata significativamente superiore a quella rilevata nel bovino, che, peraltro, presentava una percentuale significativamente inferiore di granulociti eosinofili. In entrambe le specie, infatti, si è osservata una discreta contaminazione da parte di granulociti eosinofili e cellule mononucleate (linfociti e monociti) ed una correlazione positiva tra il numero di PMN nel sangue e quello dei PMN isolati (P<0,001; r=0,66 per la pecora; r=0,74 per il bovino). La percentuale di recupero dei neutrofili rispetto a quelli di partenza, infine è risultata significativamente più elevata nel bovino. Tabella 1. Valori medi (± D.S.) relativi a vitalità, purezza e recupero delle popolazioni cellulari isolate dal sangue di pecora e di bovino Vitalità % Purezza % Recupero % granulociti neutrofili granulociti eosinofili cellule mononucleate Ovino 96,9 ± 1,4 68,5 ± 13,4 17,1 ± 12,2 14,5 ± 10,3 34,8 ± 16,7 Bovino 97,3 ± 0,8 74,6 ± 13,3 9,1 ± 9,4 16,3 ± 11,5 47,2 ± 22 n.s. * *** n.s. ** Aderenza Per quanto riguarda l’aderenza (tabella 3) la variabilità tra soggetti risulta molto elevata. Tabella 3. Valori medi (± D.S.) relativi all’aderenza rilevata nel bovino e nella pecora (D.O. x 1.000) in condizioni basali e dopo attivazione ottenuta per contatto con la plastica (Aspecifica), per aggiunta di forbolmiristato acetato (PMA, Specifica) o mediante entrambi i metodi (Mista) Basale Aspecifica Specifica Mista ANOVA LSD Ovino 112,9 ± 124,7 185,9 ± 157,1 258,1 ± 141,5 246,2 ± 137,6 *** ** Asp vs Bas; *** Sp e Misto vs Bas; ** Sp vs Asp; * Misto vs Asp Bovino 95,9 ± 123,3 173,4 ± 164,4 213,5 ± 146,8 216,2 ± 144,9 * * Sp e Misto vs Bas ns ns ns ns Il semplice contatto con la plastica è in grado di indurre un significativo aumento dell’aderenza solo nella specie ovina. L’aggiunta del PMA 10-7 mol/l, attiva l’aderenza dei PMNs bovini ed induce un ulteriore aumento di aderenza nella specie ovina. La doppia stimolazione, aspecifica e con PMA, non esercita, invece, effetti additivi in nessuna delle due specie esaminate. Chemiotassi I valori relativi alla motilità spontanea e dopo stimolazione con ZAS e IL-8 sono riportati in Tab 2 Tabella 2. Valori medi (± D.S.) relativi alla motilità spontanea (espressa in µm) ed a quella rilevabile dopo attivazione con siero omologo attivato con Zymosan (ZAS) o con interleuchina-8 ricombinante umana (IL-8) nel bovino e nella pecora C ZAS IL8 C vs ZAS ANOVA LSD test Ovino 79,7 ±25,0 98,4 ± 21,5 105,8 ± 32,3 *** *** *** ZAS e IL8 vs C Bovino 27,3 ± 16,9 75,6 ± 43,9 16,0 ± 6,4 *** *** *** ZAS vs C e IL8 *** * *** La motilità spontanea è risultata significativamente maggiore nella pecora. La stimolazione con ZAS e IL-8 induce nella pecora un aumento significativo e sovrapponibile della distanza percorsa dai PMN. Nel bovino solo lo ZAS è in grado di stimolare la chemiotassi mentre la IL-8 risulta inattiva. Anche la chemiotassi indotta da ZAS risulta comunque superiore nella pecora rispetto al bovino. Inglobamento di particelle I risultati ottenuti sono riportati in tabella 4. Tabella 4. Valori medi (± D.S.) relativi alla capacità di inglobamento di particelle di latice (D.O. x 1.000) rilevata nel bovino e nella pecora inglobamento Ovino 263,6 ± 247,1 Bovino 241,0 ± 242,6 n.s. Questo parametro presenta, sia nel bovino che nell’ovino, una elevata variabilità individuale, che rende non significativo un confronto quantitativo tra le due specie. Produzione di anione superossido (SO) La produzione di SO (tabella 5) in condizioni basali appare molto scarsa in entrambe le specie. Tabella 5. Valori medi (± D.S.) relativi alle nanomoli di anione superossido prodotte in 40 minuti nel bovino e nella pecora (D.O. x 1.000) in condizioni basali e dopo attivazione ottenuta per contatto con la plastica (Aspecifica), per aggiunta di forbolmiristato acetato (PMA, Specifica) o mediante entrambi i metodi (Mista) Basale Aspecifica Specifica Mista ANOVA LSD test Ovino 0,17 ± 0,17 0,31 ± 0,27 2,32 ± 0,91 2,32 ± 0,80 *** *** Sp e Misto vs Bas e Asp Bovino 0,22 ± 0,25 0,04 ± 0,20 2,07 ± 0,49 2,28 ± 0,57 *** *** Sp e Misto vs Bas e Asp ns *** * ns Nel bovino, come nell’ovino, il contatto con la plastica non stimola la liberazione di SO, mentre tutte due le specie risultano sensibili all’azione del PMA alla concentrazione di 10-7 mol/l. La stimolazione mista, plastica e PMA, non causa un ulteriore incremento nella produzione di SO. Il comportamento dei pozzetti contenenti SOD (bianco) risulta differente nelle due specie. Nella pecora l’aggiunta di SOD, che inibisce la produzione di SO, riduce praticamente a zero il valore di assorbanza rispetto al bianco acellulare contenente i soli reagenti. Nel bovino invece i valori del bianco contenente SOD tendono progressivamente a diminuire rispetto al bianco acellulare, in maniera più spiccata dopo stimolazione con PMA. 4. Conclusioni Il corretto funzionamento delle difese aspecifiche è fondamentale per garantire lo stato di salute, e quindi il benessere dell’animale, attraverso la pronta eliminazione dei microrganismi diffusi nell’ambiente. Tutte le tappe del processo fagocitario sono ugualmente importanti, come dimostrato dalla compromissione anche di una sola di queste attività, che si verifica ad esempio nel caso di malattie ereditarie riguardanti le capacità adesive dei PMN (Leukocyte Adhesion Deficiency), segnalate nel bovino (Kehrli et al., 1992) e nel cane (Giger et al. 1987; Trowald-Wigh et al., 1999), la chemiotassi (Gallin et al., 1980) o la risposta ossidativa (malattia granulomatosa cronica) (Zinkl e Kabbur, 1997). Nel corso della vita produttiva dei ruminanti sono segnalate alterazioni acquisite delle difese aspecifiche in particolari momenti fisiopatologici (peri-partum, stress, ecc) (Henricks et al., 1987, Saad et al., 1989), e a seguito di patologie metaboliche quali la chetosi (Kuzma et al., 1997) per la presenza in circolo di sostanze a probabile azione immunosoppressiva (Dosogne et al., 1999; Sartorelli et al., 1999a; Sartorelli et al., 1999b). Le indagini comparate risultano indispensabili per acquisire conoscenze relative alle differenze di specie, per quanto riguarda sia l’entità della risposta, sia la sensibilità a sostanze stimolanti che possono condizionare le risposte funzionali. E’ quindi importante disporre di metodiche che consentono di effettuare uno screening completo delle diverse attività funzionali dei PMN, applicabile a specie differenti. Il metodo da noi impiegato per l’isolamento dei PMN è frequentemente utilizzato nei ruminanti e permette di ottenere una popolazione cellulare adeguata, sia dal punto di vista qualitativo, in termini di rappresentatività della popolazione di partenza, di purezza e di vitalità, sia dal punto di vista quantitativo, essendo il numero di cellule recuperate sufficiente all’espletamento dell’intero pannello di test funzionali, partendo da una quantità di sangue (40 ml) che è possibile ottenere senza problemi anche da un piccolo ruminante. La presenza di cellule (eosinofili, cellule mononucleate), che potrebbero interferire con le prove effettuate, risulta contenuta, anche se non è possibile escludere una influenza indiretta, tramite la produzione di citochine, in particolare da parte di linfociti e monociti (Mulder and Colditz, 1993; Salak et al., 1993). Le popolazioni cellulari ottenute dalla pecora e dal bovino risultano comunque sovrapponibili e di conseguenza i risultati delle diverse prove funzionali sono correttamente comparabili. Le piccole differenze di purezza e recupero appaiono imputabili al fatto che il metodo non consente di concentrare i PMN, come indicato dalla correlazione significativa tra il numero di PMN nel sangue e quelli isolati, e di conseguenza la maggior presenza di eosinofili nel sangue ovino si ripercuote anche sulla popolazione cellulare isolata. E’ da sottolineare comunque che nessuno degli animali impiegati nel presente lavoro presentava alterazioni del quadro ematologico. La capacità di aderire all’endotelio, condizionando la capacità dei PMN di fuoriuscire dai vasi nel corso del processo infiammatorio, rappresenta la prima tappa del processo fagocitario, e la sua importanza è testimoniata dalla particolare gravità assunta da infezioni batteriche, peraltro comuni, in soggetti di specie diverse (uomo, bovino, cane) che presentano deficit su base genetica di questa attività (Kehrli et al., 1992; Giger et al., 1987; Trowald-Wigh et al., 1999). L’aderenza risulta quantitativamente sovrapponibile nel bovino e nell’ovino, anche se questo parametro presenta in ogni caso notevoli variazioni individuali, in parte responsabili dell’assenza di significatività statistica. Il contatto con superfici elettronegative come la plastica (ed in vitro la membrana basale e il collagene), è in grado, in particolare nella pecora, di attivare la capacità adesiva dei PMN, anche se in maniera minore rispetto a sostanze, quali il PMA, che in vivo sono prodotte da agenti infettivi e che stimolano efficacemente sia i PMN ovini che quelli bovini. Nel bovino è stata evidenziata l’espressione della molecola di adesione CD-18 dopo stimolazione con PMA (Nagahata et al., 1995), mentre non sono disponibili segnalazioni circa l’effetto del contatto con la plastica. Il PMA sembra determinare una risposta massimale, dato che la stimolazione combinata, plastica-PMA, non determina ulteriori incrementi dell’aderenza. La tappa successiva, la chemiotassi, presenta invece differenze tra le due specie, sia quantitative che qualitative. La motilità spontanea risulta significativamente inferiore nel bovino rispetto alla pecora. Questo non sembra imputabile ad uno stato di pre-attivazione dei PMN ovini (in vivo o a seguito delle manipolazioni in vitro), in quanto i valori relativi ad altre attività funzionali (ad es. la produzione di SO) rientrano nei livelli segnalati per PMN ovini a riposo (Albertine e Gee, 1996). Anche dopo stimolazione con ZAS, in cui sono presenti fattori chemiotattici derivati dall’attivazione del complemento, la distanza percorsa dai PMN ovini risulta superiore. Lo ZAS si conferma comunque una sostanza in grado di stimolare i movimenti direzionali nei PMN dei ruminanti (Mulder e Colditz, 1993; Paltrinieri et al., 1996), che, come quelli di altri ungulati, sono insensibili al peptide chemiotattico formyl-metionyl-leucyl-phenylalanine (f-MLP), impiegato per quelli umani (Gray et al., 1982). I PMN bovini invece, a differenza di quelli ovini appaiono scarsamente sensibili all’IL-8, citochina ad azione chemiotattica attiva in numerose specie. La elevata omologia (96%) tra la sequenza aminoacidica dell’ IL-8 ovina e bovina (Caswell et al. 1999) induce a ritenere tale risultato imputabile ad una minore espressione del recettore specifico o a differenze nel pattern postrecettoriale nella specie bovina piuttosto che a sostanziali differenze di struttura tra i recettori delle due specie. La capacità di inglobamento di particelle di latice, non richiedendo l’impiego di opsonine (Karnovsky e Bolis, 1992), è indicativa dell’attività di ingestione “basale”, indipendente dalla presenza di recettori e dalla compartecipazione del sistema immunitario specifico. Questa attività funzionale risulta sovrapponibile tra le due specie indagate; va sottolineato tuttavia che anche in soggetti sani questo parametro presenta comunque una elevata variabilità individuale, peraltro già segnalata (Paape e Pearson, 1979). La produzione di SO è una misura della capacità battericida dei PMN, esplicata tramite la liberazione di composti attivi dell’ossigeno (Respiratory burst). E’ quindi la tappa finale del processo fagocitario, che ha come risultato quello di uccidere e degradare l’agente infettivo. I composti attivi dell’ossigeno possono essere diversi (SO, perossido di idrogeno, ossigeno singoletto, acido ipocloroso ecc); la metodica impiegata (Bellavite et al., 1992) prevede il dosaggio della quota di SO che è inibita dalla SOD, quindi quella prodotta dalla attivazione della NADPH ossidasi di membrana. La differenza di comportamento del bianco contenente SOD induce a ritenere che i composti dell’ossigeno prodotti nelle due specie siano quali-quantitativamente differenti. La ri-ossidazione del citocromo C, risultante in una progressiva riduzione dei valori di D.O., evidente nel bovino già in condizioni basali, e stimolata dal PMA, fa supporre che in questa specie, più che nella pecora, venga prodotto accanto al SO un composto ad azione ossidante, come ad esempio il perossido di idrogeno (Metcalf et al., 1986). Ciò potrebbe portare ad una sottostima dei valori di SO prodotto, e giustificare in parte la differenza quantitativa emerso tra SO prodotto dai PMN bovini e ovini. In condizioni basali il SO prodotto è comunque molto scarso, a conferma che le manualità operative a cui sono sottoposti i PMN durante la purificazione in vitro non ne determina una sostanziale attivazione (Albertine e Gee, 1996). Contrariamente a quanto accade per l’aderenza, il contatto con la plastica non incrementa la produzione di SO in queste due specie. La possibilità di una dissociazione tra le due risposte è già stata segnalata nell’uomo (Bellavite et al., 1992). Il PMA 10-7 mol/l è in grado di stimolare, attraverso l’intervento di una proteina chinasi C (Dore et al., 1992), la produzione di SO sia nel bovino che nella pecora, anche se questa risulta più lenta e quantitativamente inferiore a quella dei PMN umani (Bellavite et al., 1992) in accordo con quanto riportato da altri Autori (Albertine e Gee, 1996; Heyneman et al., 1990) viene quindi confermata la scarsa capacità ossidativa dei PMN dei ruminanti (Guelfi e Courdohouhji, 1987; Buchta, 1990). La doppia stimolazione, plastica e PMA, non induce, come per l'aderenza, un ulteriore incremento del SO prodotto In conclusione, il pannello di test da noi messo a punto per i ruminanti consente di effettuare sullo stesso animale una valutazione pressoché completa dell’intero processo di fagocitosi, esplorandone le diverse tappe funzionali. L’individuazione di difetti del processo fagocitario in situazioni di particolare suscettibilità alle malattie infettive consentirebbe di attivare le necessarie misure di prevenzione a tutela della salute dell’animale. Ringraziamenti- Ricerca effettuata con contributo M.U.R.S.T. ex-40% e 60% Bibliografia Albertine K. H., Gee M.H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J. Leukoc. Biol. 1996, 59; 631-638. Bellavite P., Chirumbolo S., Mansoldo C., Gandini G., Dri P. Simultaneous assay for oxidative methabolism and adhesion of human neutrophils: evidence for correlations and dissociations of the two responses. J. Leukoc. Biol. 1992; 51,329-335. Buchta, R. Functional and biochemical properties of ovine neutrophils. Vet. Immunol. Immunopathol. 1990; 24, 97- 112. Carlson G.P., Kaneko J.J. Isolation of leukocytes from bovine peripheral blood. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1973; 142, 853-856. Caswell J.L., Middleton D.M., Gordon J.R. 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Settore VET/03 - Patologia Generale e Anatomia Patologica Veterinaria
Valutazione comparativa dell’immunità aspecifica nei ruminanti di interesse zootecnico / S. Paltrinieri, S. Comazzi, P. Sartorelli. ((Intervento presentato al 34. convegno 34° simposio internazionale di zootecnia. Workshop: strumenti innovativi per la ricerca avanzata nelle produzioni animali tenutosi a Milano nel 1999.
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