Analisi LC-MS/MS di dipeptidi istidinici e dei corrispondenti addotti di Michael con 4-idrossi-2-nonenale (HNE) nel plasma e nei tessuti di ratto

Carnosina (CAR), anserina (ANS) e omocarnosina (HCAR) sono dipeptidi istidinici (HD) presenti negli organismi vertebrati il cui ruolo biologico è a tutt’oggi in corso di definizione. Recentemente è stato da noi dimostrato che questi dipeptidi possono comportarsi da quencher di aldeidi citotossiche alfa,beta-insature, il 4-idrossi-2-nonenale (HNE), il nonenale e l’acroleina, che si originano dai processi di perossidazione degli acidi grassi poli-insaturi, ed è stato definito (analisi ESI-MS e NMR) il meccanismo di interazione, che comporta la formazione, come principali prodotti di reazione, di addotti di Michael (1-3). Scopo di questa ricerca è stata la messa a punto e convalida di un metodo LC-MS/MS semplice, sensibile e selettivo per la determinazione quantitativa simultanea sia dei dipeptidi istidinici (CAR, ANS e HCAR) che dei corrispondenti addotti di Michael con HNE (HD-HNE) in matrici biologiche (tessuti di ratto). Gli omogenati di tessuto (1:3 in tampone fosfato), addizionati con Tyr-His come standard interno (concentrazione finale 100 µM) vengono deproteinizzati con HClO4 0.7mM (1:1; v/v) ed i surnatanti sottoposti ad analisi LC-MS/MS nelle seguenti condizioni sperimentali: colonna in fase inversa C12 polar-RP (150 x 2.1 mm, 4 µm); eluizione in gradiente, utilizzando come fase mobile (A) acqua:acetonitrile:acido eptafluorobutirrico (9:1:0.01; v/v/v) e (B) acetonitrile; flusso 0.2 ml/min; rivelamento in spettrometria di massa (trappola ionica con interfaccia ESI). Le acquisizioni sono state effettuate a ioni positivi ed in modalità MRM (multiple reaction monitoring), monitorando le seguenti combinazioni di ioni precursore -> ioni prodotto: Tyr-His (SI) m/z 319 -> 301; CAR m/z 227 -> 210; ANS m/z 241->170, 197 e 224; HCAR m/z 241->156; addotto CAR-HNE m/z 383 -> 366; addotto ANS-HNE m/z 397 -> 197, 241, 326, 353 e 380. Per gli analiti dipeptidici (HD), il metodo è stato convalidato nell’intervallo di concentrazioni 15-1000 nmoli/g tessuto, e sono stati determinati i valori di LOQ e LOD, corrispondenti rispettivamente a 12.5 e 4.2 pmoli iniettate. La precisione intra e inter-day (CV%) è risultata inferiore al 10% (< 17.47 % al LOQ); l’accuratezza intra e inter-day (RE%) compresa fra ± 10% a tutte le concentrazioni. Per gli analiti HD-HNE, la convalida è stata effettuata nell’intervallo di concentrazioni compreso fra 10-100 nmoli/g con valori di LOQ e LOD corrispondenti rispettivamente a 8.1 e 3.0 pmoli iniettate. L’analisi LC-MS/MS dei diversi tessuti ha fornito i seguenti risultati: la concentrazione più elevata di CAR e ANS è stata riscontrata nel muscolo scheletrico (soleo, gastrocnemio, tibiale), con valori compresi fra 2606 e 5280 e fra 5415 e 7861 nmoli/g rispettivamente, seguito da cuore (67.03 e 64.50 nmoli/g), cervelletto (48.41 e 57.48 nmoli/g) e cervello (CAR 27.35 nmoli/g; ANS inferiore al LOQ). HCAR è stata rilevata solo nel cervello (51.14 nmoli/g) e nel cervelletto (77.64 nmoli/g). Gli addotti HD-HNE sono risultati al di sotto del LOD in tutti i campioni tissutali analizzati. Questa metodologia verrà applicata alla definizione del profilo plasmatico/tissutale di HD e di HD-HNE sia in condizioni fisiologiche (invecchiamento, sforzo fisico) che patologiche (infiammazione, danno da ischemia-riperfusione) in diversi modelli animali.