Cambiamenti del proteoma della bacca di vite (Vitis vinifera) durante la maturazione

La maturazione dell’uva coinvolge molteplici eventi biochimici e fisiologici che modificano profondamente le caratteristiche della bacca. Durante questo processo, che inizia all’invaiatura, si osservano, fra l’altro, cambiamenti strutturali della parete, l’aumento delle dimensioni del frutto, ascrivibile ad una crescita per distensione cellulare, ed il rammollimento del pericarpo. A questi eventi si accompagnano modificazioni nella composizione dei metaboliti, quali l’accumulo di zuccheri, amminoacidi e potassio, la riduzione degli acidi organici, principalmente dell’acido malico, e la comparsa di metaboliti secondari, quali tannini ed antociani.(Robinson SP and Davies C “Molecular biology of grape berry ripening” Australian journal of grape and wine research 6: 175-188; 2000). A dispetto del grande interesse per questa specie, poco conosciuti rimangono i processi molecolari e biochimici attivi durante la maturazione di questo frutto non climaterico. La presenza di elevate concentrazioni di alcuni metaboliti, quali ad esempio i composti fenolici, rende infatti particolarmente difficoltosa l’individuazione di metodiche adeguate per questo materiale sperimentale. Mentre alcune informazioni, seppure incomplete, sull’attività trascrizionale sono tuttavia ora disponibili, il profilo d’espressione proteica nelle diverse fasi di maturazione rimane pressoché sconosciuto. L’incremento delle conoscenze sul genoma di vite ottenute in questi ultimi anni ha comunque creato i presupposti necessari per avviare studi di proteomica. In questo contesto va evidenziato come la fase d’estrazione richieda una particolare attenzione. Precedenti ricerche, condotte su frutti di altre specie vegetali, hanno infatti riscontrato che molte proteine possono legarsi alla componente glucosidica della parete con conseguente creazione di artefatti; in questo contesto appare quindi prioritario studiare il profilo d’espressione proteica nelle diverse frazioni cellulari (Rose JKC et al. “Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools” The Plant Journal, 39, 715-733, 2004). Primo obbiettivo di questo lavoro è stato quello di individuare il protocollo più idoneo per l’estrazione delle proteine del protoplasto e della parete dell’esocarpo della bacca di vite, tessuto in cui viene sintetizzata la maggiore parte dei metaboliti secondari. I risultati ottenuti dall’analisi elettroforetica bidimensionale (2D-PAGE) hanno evidenziato che i campioni estratti in tampone e purificati mediante ripartizione con fenolo, precipitazione con ammonio acetato in metanolo e successivi lavaggi in acetone presentano, per entrambe le frazioni, il maggiore numero di spot rispetto ad altri protocolli testati. Circa il 15% dei peptidi sono risultati presenti in entrambe le frazioni, confermando come la procedura di estrazione incida sulla composizione dei diversi proteomi. La ricerca è quindi proseguita studiando i profili proteici nelle diverse fasi di maturazione. L’analisi 2D-PAGE ha rivelato evidenti cambiamenti d’espressione di alcuni peptidi che sono stati quindi analizzati mediante spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS, liquid chromatography – Electrospray - tandem mass spectrometry). I risultati ottenuti, seppure ancora preliminari, evidenziano le potenzialità di questo approccio sperimentale per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei i profondi cambiamenti biochimici e fisiologici che caratterizzano la maturazione della bacca di vite.