TWO NOVEL GENES DOWNSTREAM OF THE FLORIGENIC AND THE PHOTOPERIODIC INDUCTION CONTROL RICE PLANT DEVELOPMENT IN THE REPRODUCTIVE STAGE

Rice (Oryza sativa L.) is a facultative short-day plant belonging to the Poaceae family. It is a model species for grasses, and its relatively small genome and easiness of handling makes it a good model to study complicated genetic network such as flowering. Flowering is fundamental for higher plants since it leads to the generation of the offspring to perpetuate the species. Florigens are essential components in flowering, and they are produced in the leaf blades before being transported to the shoot apical meristem, where they activate the transcription of floral identity genes. In rice Hd3a and RFT1 are the florigens, which form a complex with OsFD1 and a 14-3-3 protein to activate the transcription of target genes: worth mentioning are OsMADS14, OsMADS15, OsMADS18 and OsMADS34/PAP2. My PhD project aimed to discover new genes involved in the flowering process downstream of the florigens and to compare the promotion-specificity of Hd3a and RFT1. RNA-seq experiments were conducted on transgenic lines expressing either Hd3a or RFT1 when induced with exogenous dexamethasone, and wild type, short-day (SD)-induced plants to identify differentially expressed genes. Crossing the three datasets 15 genes emerged as strongly regulated by all three inductive conditions. Among them were floral identity genes and ten uncharacterized genes. Expression analysis along reproductive transition revealed that the florigens are necessary for the regulation of eight of them, and RFT1 is a stronger activator/repressor than Hd3a. Spatial expression of three genes unveiled a similar pattern: low expression in the SAM and a marked expression at the primary and secondary branches meristems. The attention was then focused on two of the uncharacterized genes, an F-BOX containing protein and a MAIN-like protein, by generating knock-out lines using CRISPR/Cas9 technology. Phenotypic analysis of homozygous plants has shown that the genes are involved in collateral processes, rather than flowering itself: the F-BOX protein, encoded by Broader Tillering1 (BRT1), regulates tiller angle during short induction, besides suppressing bract-like structures in the panicle; the MAIN-like gene, OsMAIL1, is involved in the activation of genes that specify carpel identity.

Il riso (Oryza sativa L.) è una pianta a giorno corto facoltativa appartenente alla famiglia delle Poaceae. È una specie modello per le piante erbacee a causa del genoma relativamente piccolo e la facilità di gestione, in particolare quando si tratta di studiare network genetici complessi come quello riguardante la fioritura. Fiorire è un processo fondamentale per le piante superiori, dato che ha come fine ultimo la generazione di progenie per garantire la sopravvivenza della specie. I florigeni sono componenti essenziali nella fioritura: vengono prodotti nelle lamine fogliari per poi essere trasportati al meristema apicale del germoglio, dove attivano la trascrizione dei geni di identità fiorale. In riso i florigeni sono Hd3a e RFT1, i quali formano un complesso con OsFD1 mediato da proteine 14-3-3 che attiva la trascrizione di geni target: OsMADS14, OsMADS15, OsMADS18 and OsMADS34/PAP2. Poco è noto di altri target. Lo scopo del progetto è quello di scoprire nuovi geni coinvolti nel processo di fioritura a valle dei florigeni, oltre che di comparare la specificità di attivazione data da Hd3a e RFT1. Tre esperimenti di RNA-seq sono stati condotti su piante che esprimevano solo Hd3a, piante che esprimevano solo RFT1, e piante indotte da condizioni di giorno corto per identificare i geni differenzialmente espressi. Dall’incrocio delle tre collezioni di dati sono emersi 15 geni come fortemente regolati in tutte e tre lo condizioni di induzione. Tra di loro, si ritrovano i geni di identità fiorale oltre a dieci geni non caratterizzati. L’analisi di espressione durante la transizione riproduttiva ha mostrato che i florigeni sono necessari per la regolazione di otto di essi, oltre al fatto che RFT1 è un attivatore/repressore più forte rispetto ad Hd3a. La localizzazione spaziali di tre geni esemplificativi è simile: poco espressi nel meristema vegetativo, ed un’espressione più accentuata nei meristemi dei rami primari e secondari della pannocchia. L’attenzione si è poi spostata su due fra i geni non caratterizzati, codificanti per una proteina F-BOX ed un MAIN-like, sfruttando la tecnologia CRISPR/Cas9 per generare mutanti non funzionali. L’analisi fenotipica di piante omozigoti per l’allele non funzionale ha rivelato che questi geni sono coinvolti in processi collaterali alla fioritura: la proteina F-BOX, BRT1, regola l’angolo dei culmi durante l’induzione da giorno corto, oltre a sopprimere la formazione di brattee nella pannocchia; il gene MAIN-like, OsMAIL1, è coinvolto nell’attivazione di geni che specificano l’identità del carpello.