The worldwide life expectancy has experienced a dramatic rise in the last century, resulting in an increase in the proportion of people aged over 65 years old. Unfortunately, this increase in longevity has not been accompanied by an increase in the years of "disease-free life". Rather, the incidence and impact (social and economic) of age-associated diseases have increased in parallel. Thus, the study of the mechanisms associated with aging is an area of vital importance to identify which characteristics of aging are related to the appearance of age-associated pathologies, such as cardiovascular diseases, cancer and neurodegenerative disorders. In addition, the aging of the population is represented by the emergence of specific concomitant conditions, including loss of cognitive and physical function, polypharmacy or multimorbidity. In this sense, it is key to consider the extensive communication that exists between different tissues and organ systems. That is, changes that occur at the systemic level can have an effect at the central nervous system level, and vice versa. Several evidence have pointed out that aging manifests at the clinical level when there is an imbalance between cell damage and compensatory mechanisms. However, it is evident that this process, as well as the susceptibility to multimorbidity, affects individuals in a heterogeneous manner. This individual variability can be explained by the interaction among different biological factors, such as genetics or biological sex, and external factors, such as the environment, diet or socioeconomic determinants. In particular, the role of biological sex and gender in different pathologies, prognosis and response to treatments has been increasingly recognized. However, the inclusion of sex (and gender) as a variable still represents a need in clinical and preclinical research. Performing aging studies in human patients presents several obstacles. In this sense, the use of experimental models is very useful in pre-clinical phases and can help to understand the nature of the mechanisms underlying aging and how their interactions may predispose to pathology. In recent years, the Octodon degus (O. degus) has been proposed as a relevant tool in biomedical research. Unlike traditional rodents, the O. degus is diurnal and shows several biological characteristics similar to humans, including the development of some pathological traits associated with human aging. Among them, it has been evidenced the spontaneous appearance of pathological features such as beta-amyloid plaques and phosphorylated tau protein deposits, as well as postsynaptic dysfunction. Likewise, there is a high degree of homology with the most frequent neurodegenerative disease-related proteins (beta-amyloid, tau, alpha-synuclein and APOE). In addition, some age-related changes have been described in this model, such as astrocytic activation and oxidative stress markers, neuronal apoptosis, white matter changes similar to those of human aging, cognitive and behavioral dysfunction, type II diabetes, cataracts, retinal alterations and circadian rhythm changes. For all these reasons, this model represents a promising alternative to reproduce the multimorbidity scenario found in human aging. However, several aspects of the O. degus biology have not been characterized yet. With this in mind, the main objective of this thesis was the characterization of the O. degus as a natural model of aging by exploring systemic and brain changes along aging, as well as their interaction, including sex as an experimental variable. For this purpose, studies were performed on a total of 110 animals aged from 6 months old to 7 years old, which were divided according to age, sex or treatments. The data presented in this thesis are the result of the combination of in vivo analyses (plasma analytes, cardiac function and behavior), with the post mortem evaluation in different brain areas of neuroinflammatory processes, changes in lipid composition, lipid peroxidation and neuronal death. The first block of results of this work provides the sex-specific values of the biochemical profile in the blood of O. degus during aging. The analytes determined allowed us to examine the general metabolism, hepatic, renal and pancreatic functions, oxidation and inflammatory status. We found that most parameters were significantly altered in aged animals, with differences between males and females. The analytes analyzed indicated that these animals develop hepatic, renal and pancreatic dysfunction associated with aging. Also, plasma oxidation and inflammation levels were significantly increased in older animals compared to younger animals. Differences between males and females were also found along aging, specially in the analytes related to general and liver, muscle, and kidney metabolism, to redox-status or to inflammatory status. The biggest differences were related to oxidative status, suggesting higher oxidation in males versus females. Due to the high inter-individual variability of the data, especially accentuated in the older groups, the statistical analyses did not show significant differences in some parameters, such as glucose levels or inflammation indicators. This situation is of great interest since, taking into account that the animals in this study are not genetically identical and that they have been maintained in the same environmental conditions, only some of them are susceptible to develop sub-clinical pathological states that may predispose to the development of chronic diseases associated with aging. The second block of results shows the study of in vivo cardiac function evaluated by electrocardiography. In this section, the normal ranges for the heart rate, duration and voltage of the electrocardiogram waves and intervals, as well as electrical axis deviation, were determined. The statistical analysis revealed that the parameters that showed the greatest differences according to sex were the higher incidence of arrhythmias and greater deviation of the electrical axis of the heart in males than in females. Likewise, some electrocardiogram modifications were detected when comparing the different ages. Heart rate decreased significantly at older ages, with males being more affected than females. QRS complex duration was significantly increased in females as they aged, but not in males. Finally, the QT interval duration of younger females was significantly shorter than that of males of the same age, while in the senile stage this situation was reversed. Therefore, the data obtained showed that O. degus develop spontaneous cardiac alterations associated with aging that differ between males and females, adding value to this model for use as a natural model for investigations of the cardiovascular system. Thirdly, we analyzed the cognitive impairment associated with aging with a sex perspective, and its possible relationship with the neuroinflammatory status (microglia and astrocytes) in the dorsal hippocampus. Considering the effect of age, aged O. degus (>4 years) showed a very significant cognitive impairment when they were compared to young animals. Interestingly, when possible differences associated with the sex were investigated, we found that they were significant in the aged animals: during the training sessions, the aged females showed a better performance than the aged males, which was reversed on the day of the final test. Post mortem studies revealed that, in all dorsal hippocampal subareas analyzed, neuroinflammation was significantly increased in older animals, being the basal immunolabeling levels for microglia and astrocytes higher in males than in females. Correlation analyses indicated that increased neuroinflammation is related to worse cognitive performance, especially in the dentate gyrus and Cornu Ammonis subfield 1. The information derived from these studies characterizes for the first time age-associated cognitive decline in O. degus and its relationship to neuroinflammation in the dorsal hippocampus, with a component of inter-individual variability. The fourth block of results corresponds to the analysis of the lipid composition in the brain of O. degus during aging, in both males and females. For this purpose, four brain areas were analyzed: prefrontal cortex (PFC), striatum, cortex and cerebellum. Analysis of total lipid extracts showed that changes in lipid species in the PFC, striatum and cortex were more influenced by the age of the animals than by their sex, while in cerebellum both variables influenced more significantly the lipid composition. The changes observed during aging were region-specific, those in glycosphingolipids being common to all regions. The greatest sex-associated differences were found in gangliosides at all ages, while sphingomyelin and sulfatides were significantly different when comparing males and females of senile age. Finally, given its key role in spatial memory circuits, lipid peroxidation (POL) was analyzed in the PFC. We found that it was significantly increased along aging, males showing significant higher levels of POL than females. In addition, higher POL significantly correlated with worse cognitive performance. On the one hand, these results represent a first piece of information in the brain lipid characterization of this model. On the other hand, these data support the inclusion of sex as a variable to understand differential age-associated neurodegeneration, as well as the higher prevalence of certain diseases such as Alzheimer's disease. Finally, we validated the use of O. degus as a model of experimental Parkinsonism based on 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro-pyridine (MPTP) intoxication. MPTP intoxicated animals showed dysregulation of blood glucose levels, together with motor and cognitive alterations. Post-mortem analysis revealed a very significant loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) and in the ventral tegmental area (VTA), although dopaminergic terminals were not altered. Similarly, a highly significant reduction of noradrenergic neurons in the locus coeruleus (LC) was detected in MPTP-intoxicated animals. These findings were accompanied by a significant increase in microglial and astroglial response in the ventral midbrain (SNpc and VTA), striatum, dorsal hippocampus and LC of parkinsonized animals. These results demonstrate, for the first time, that O. degus is sensitive to MPTP-induced neurotoxicity, and therefore it is proposed as a suitable model for the study of experimental Parkinsonism beyond the motor circuits. In summary, this research represents a reasonable contribution to the scientific community in different aspects. On the one hand, a longitudinal study of the present dimensons considering both males and females in the O. degus had never been done before. First place, it provides validation of different experimental procedures and protocols in this species. Second place, the results presented in this thesis contribute to a better characterization of the O. degus, providing a starting point for future studies in the field of physiopathology and guidelines for veterinary care to early diagnosis and monitorization. On the other hand, the findings obtained support the validity of this species as a unique tool for aging research in the context of multimorbidity, possesing similarities with humans that are not present in other preclinical models. In additionally, the sex-related differences found increase the value of this model, since it offers the possibility of approaching different scientific questions from the sex perspective. Finally, the results derived from the present project set the basis for future studies that focus both in the better characterization of the model and in the individual susceptibility to different age-associated disorders considering the sex differences.

L'aspettativa di vita a livello globale è aumentata drasticamente nell'ultimo secolo, con il conseguente aumento della percentuale di persone con più di 65 anni. Purtroppo, l’aumento della longevità non è stato accompagnato da un aumento degli anni di "vita libera dalla malattia". Al contrario, l'incidenza e l'impatto (sociale ed economico) delle malattie legate all'età sono aumentati in parallelo. Per tutti questi motivi, lo studio dei meccanismi associati all'invecchiamento è un'area di vitale importanza per identificare quali caratteristiche dell’invecchiamento sono correlate alla comparsa di patologie associate all'età, come le malattie cardiovascolari, il cancro e i disturbi neurodegenerativi. Inoltre, l'invecchiamento della popolazione è caratterizzato dall’insorgenza di specifiche condizioni concomitanti, tra cui la perdita di funzioni cognitive e fisiche, la politerapia o la multimorbilità. A questo proposito, è fondamentale considerare l'ampia comunicazione che esiste tra diversi tessuti e sistemi di organi. In altre parole, i cambiamenti che si verificano a livello sistemico possono avere un effetto a livello del sistema nervoso centrale e vice versa. È dimostrato che l'invecchiamento si manifesta a livello clinico quando c'è uno squilibrio tra il danno cellulare e i meccanismi di compensazione. È evidente, però, che questo processo e la predisposizione alla multimorbilità si manifestano in modo eterogeneo tra diversi individui. Questa variabilità individuale appare come il risultato dell'interazione tra diversi fattori biologici, come la genetica o il sesso biologico, e fattori esterni, come l'ambiente, la dieta o i fattori di condizionamento socioeconomici. In particolare, negli ultimi decenni è stato sempre più riconosciuto il ruolo del sesso biologico e del genere nella comparsa di diverse patologie, nella prognosi e nella risposta ai trattamenti. Nonostante ciò, l'inclusione del sesso (e del genere) come variabile rappresenta ancora una necessità nella ricerca clinica e preclinica. La ricerca sull'invecchiamento nei pazienti umani presenta degli ostacoli. In questo senso, l'uso di modelli sperimentali è molto utile nelle fasi precliniche e può aiutare a comprendere la natura dei meccanismi alla base dell'invecchiamento e come le sue interazioni possano predisporre alla patologia. Negli ultimi anni, l'Octodon degus (O. degus) è stato proposto come modello importante per la ricerca biomedica. A differenza dei roditori tradizionali, l’O. degus è diurno e presenta svariate caratteristiche biologiche simili all'uomo, compreso lo sviluppo di alcuni tratti patologici associati all'invecchiamento umano; tra questi, sono stati descritti la comparsa spontanea di placche di beta-amiloide e depositi di proteina tau fosforilata e disfunzioni postsinaptiche. Esiste anche un elevato grado di omologia con le più comuni proteine associate alle malattie neurodegenerative (beta-amiloide, tau, alpha-sinucleina e APOE). Inoltre, in questo modello sono stati descritti alcuni cambiamenti legati all'età, come attivazione astrocitaria e marcatori dello stress ossidativo, apoptosi neuronale, alterazioni della materia bianca simili a quelle dell'invecchiamento umano, disfunzioni cognitive e comportamentali, diabete di tipo II, cataratta, alterazioni della retina e cambiamenti del ritmo circadiano. Pertanto, questo modello rappresenta un'alternativa promettente per riprodurre lo scenario di multimorbilità che si riscontra nell'invecchiamento umano. Tuttavia, diversi aspetti della biologia dell’O. degus non sono stati caratterizzati ancora. Con queste premesse, l'obiettivo principale di questa tesi è stato quello di utilizzare il modello di invecchiamento naturale O. degus per esplorare i cambiamenti sistemici e cerebrali che si verificano con l'età, nonché la loro interazione, tenendo conto dell’influenza del sesso. A tal fine, sono stati condotti studi su un totale di 110 animali di età compresa tra i 6 mesi e i 7 anni, suddivisi per età, sesso o trattamento. I dati presentati in questa tesi sono il risultato della combinazione dell’analisi in vivo (analiti plasmatici, funzione cardiaca e comportamento), con la valutazione post mortem in diverse aree cerebrali dei processi neuroinfiammatori, cambiamenti nella composizione lipidica, perossidazione lipidica e morte neuronale. La prima parte dei risultati di questo lavoro comprende l’analisi del profilo biochimico specifico del sesso nel sangue di O. degus durante l'invecchiamento. Gli analiti studiati ci hanno permesso di esaminare il metabolismo generale, le funzioni epatiche, renali e pancreatiche, lo stato ossidativo e infiammatorio. Abbiamo riscontrato che la maggior parte dei parametri era significativamente alterata negli animali invecchiati, con differenze tra machi e femmine. In particolare, i livelli di proteine totali, colesterolo e calcio sono risultati significativamente più elevati negli O. degus anziani rispetto a quelli più giovani. Gli analiti analizzati hanno indicato che questi animali sviluppano disfunzioni epatiche, renali e pancreatiche associate all'invecchiamento. Inoltre, i livelli di ossidazione e infiammazione plasmatica sono risultati significativamente più elevati negli animali anziani rispetto a quelli giovani. Nell’invecchiamento, differenze legate al sesso sono state trovate, soprattutto nei marcatori del metabolismo epatico, muscolare e renale, negli stati redox e infiammatori. Le differenze maggiori sono state riscontrate nello stato ossidativo, con livelli più elevati nei maschi rispetto alle femmine. A causa dell'elevata variabilità interindividuale dei dati, soprattutto nei gruppi più anziani, le analisi statistiche non hanno mostrato differenze significative in alcuni parametri, tra cui i livelli di glucosio o gli indicatori di infiammazione. Questa situazione è di grande interesse poiché, tenendo conto che gli animali di questo studio non sono geneticamente identici e che sono stati tenuti in condizioni ambientali identiche, solo alcuni di essi sono suscettibili allo sviluppo di stati patologici sub-clinici che possono predisporre all’insorgenza di malattie croniche associate all'invecchiamento. Il secondo blocco di risultati è relativo allo studio della funzione cardiaca in vivo, valutata mediante elettrocardiografia. In questa sezione sono stati determinati gli intervalli di normalità per la frequenza cardiaca, la durata e il voltaggio delle onde e degli intervalli dell’elettrocardiogramma, nonché la deviazione dell'asse elettrico. L'analisi statistica ha rivelato che i parametri che mostravano le maggiori differenze in base al sesso sono stati la maggiore incidenza di aritmie e la maggiore deviazione dell'asse elettrico del cuore nei maschi rispetto alle femmine. Inoltre, sono state rilevate alcune modifiche dell'elettrocardiogramma nel confronto tra le diverse età. La frequenza cardiaca è diminuita in modo significativo negli animali di età più avanzata, con i maschi più colpiti delle femmine. La durata del complesso QRS è aumentata significativamente nelle femmine con l'avanzare dell'età, ma non nei maschi. Infine, la durata dell'intervallo QT delle femmine più giovani era significativamente più breve rispetto a quello dei maschi della stessa età, mentre nella fase senescente la situazione era invertita. Pertanto, i dati ottenuti mostrano che O. degus sviluppa alterazioni cardiache spontanee associate all'invecchiamento che differiscono tra maschi e femmine, il che aggiunge valore al suo potenziale utilizzo come modello naturale per le indagini sul sistema cardiovascolare. In terzo luogo, abbiamo analizzato il deterioramento cognitivo associato all'invecchiamento in modo genere-dipendente e la sua possibile relazione con lo stato neuroinfiammatorio (microglia e astrociti) nell'ippocampo dorsale. Durante tutte le fasi sperimentali gli O. degus anziani (>4 anni) hanno mostrato un declino cognitivo molto significativo rispetto agli animali giovani. È interessante notare che, indagando le possibili differenze associate al sesso degli animali, abbiamo riscontrato che queste, pur non essendo state riscontrate negli animali più giovani, erano significative in quelli più anziani. Pertanto, nelle varie sessioni di allenamento, le femmine hanno mostrato una performance migliore rispetto ai maschi; la situazione si è invertita nel giorno del test finale. Gli studi post mortem hanno rivelato che, in tutte le sotto-aree dell'ippocampo dorsale analizzate, la neuroinfiammazione aumentava significativamente negli animali più anziani, con livelli di immunomarcatura basale per microglia e astrociti più elevati nei maschi rispetto alle femmine. Le analisi di correlazione hanno indicato che l'aumento della neuroinfiammazione è correlato a prestazioni cognitive peggiori, soprattutto nelle aree del giro dentato e del Cornu Ammonis (regione 1). Le informazioni derivate da questi studi dimostrano per la prima volta il declino cognitivo associato all'età in O. degus e la sua relazione con la neuroinfiammazione nell'ippocampo dorsale, con una componente di variabilità interindividuale. Il quarto blocco di risultati corrisponde all'analisi della composizione lipidica nel cervello di O. degus durante l'invecchiamento, in relazione al sesso. A tal fine, sono state analizzate quattro aree cerebrali: corteccia prefrontale (CPF), striato, corteccia e cervelletto. L'analisi degli estratti lipidici totali ha mostrato che le variazioni delle specie lipidiche nella CPF, nello striato e nella corteccia erano più influenzate dall'età degli animali che dal sesso, mentre nel cervelletto entrambe le variabili influenzavano la composizione lipidica. I cambiamenti osservati durante l'invecchiamento sono specifici per ogni regione, mentre quelli dei glicosfingolipidi sono comuni a tutte le regioni. Le maggiori differenze legate al sesso sono state riscontrate nei gangliosidi, a tutte le età, mentre la sfingomielina e i solfatidi sono risultati significativamente diversi nel confronto tra maschi e femmine in età senile. Infine, dato il suo ruolo chiave nei circuiti della memoria spaziale, nella CPF è stata analizzata la perossidazione lipidica (POL), di cui ne è stato riscontrato un aumento significativo durante l'invecchiamento e nel confronto tra maschi e femmine. Inoltre, una POL più elevata correlava in modo significativo con prestazioni cognitive peggiori. Questi risultati, da un lato rappresentano una prima informazione nella caratterizzazione dei lipidi cerebrali di questo modello, dall’altro confermano che il sesso costituisce un’ulteriore variabile per comprendere il diverso grado di neurodegenerazione associata all'età, nonché la diversa incidenza di alcune malattie, come il morbo di Alzheimer, in maschi e femmine. Infine, O. degus è stato validato come modello di parkinsonismo sperimentale basato sull'intossicazione da 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Gli animali intossicati da MPTP hanno mostrato una disregolazione dei livelli di glucosio nel sangue, oltre a disturbi motori e cognitivi. L'analisi post mortem ha rivelato una perdita notevolmente significativa di neuroni dopaminergici nella Substantia Nigra pars compacta (SNpc) e nell'area tegmentale ventrale (ATV), sebbene i terminali dopaminergici non fossero alterati. Analogamente, negli animali intossicati da MPTP è stata rilevata una riduzione altamente significativa dei neuroni noradrenergici nel locus coeruleus (LC). Questi risultati sono stati accompagnati da un aumento significativo delle risposte microgliali e astrogliali nel mesencefalo ventrale (SNpc e ATV), nello striato, nell'ippocampo dorsale e nel LC degli animali “parkinsonizzati”. Questi risultati dimostrano, per la prima volta, che O. degus è sensibile alla neurotossicità indotta dall'MPTP, rendendolo un modello adatto per lo studio del parkinsonismo sperimentale, al di là della compromissione motoria. In conclusione, questa ricerca offre un contributo ragionevole alla comunità scientifica sotto diversi aspetti. Da un lato, uno studio longitudinale di questa portata che considera maschi e femmine in O. degus non è mai stato condotto prima. In primo luogo, fornisce la convalida di protocolli che non erano stati utilizzati in precedenza in questa specie. In secondo luogo, i risultati presentati in questa tesi contribuiscono a una migliore caratterizzazione di O. degus, fornendo un punto di partenza per futuri studi sulla fisiopatologia e linee guida veterinarie per la diagnosi precoce e il monitoraggio delle alterazioni. D'altra parte, i risultati ottenuti confermano che questa specie è uno strumento unico per la ricerca sull'invecchiamento nel contesto della multimorbilità, con somiglianze con l'uomo che non sono presenti in altri modelli preclinici. Inoltre, le differenze associate al sesso riscontrate aumentano il valore di questo modello, in quanto offre la possibilità di affrontare studi futuri da una prospettiva sessuale in fisiologia e patologia. Infine, i risultati presentati in questa tesi pongono le basi per studi futuri che si concentrano sia sull'ulteriore caratterizzazione del modello sia sulla suscettibilità individuale allo sviluppo di malattie associate all'età, con la possibilità di studiare le differenze di sesso.

SYSTEMIC ALTERATIONS AND BRAIN CHANGES IN PHYSIOLOGY AND PATHOLOGY. THE OCTODON DEGUS AS A MODEL OF AGING AND MULTIMORBIDITY / L. Cuenca Bermejo ; TUTORS: A. PRINETTI, M.T. HERRERO EZQUERRO ; COORDINATOR UNIMI: C. SFORZA ; COORDINATOR UNIVERSITY OF MURCIA: E. LARQUÉ DAZA. Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, 2023 Jun 15. 34. ciclo, Anno Accademico 2021.

SYSTEMIC ALTERATIONS AND BRAIN CHANGES IN PHYSIOLOGY AND PATHOLOGY. THE OCTODON DEGUS AS A MODEL OF AGING AND MULTIMORBIDITY

L. CUENCA BERMEJO
2023

Abstract

The worldwide life expectancy has experienced a dramatic rise in the last century, resulting in an increase in the proportion of people aged over 65 years old. Unfortunately, this increase in longevity has not been accompanied by an increase in the years of "disease-free life". Rather, the incidence and impact (social and economic) of age-associated diseases have increased in parallel. Thus, the study of the mechanisms associated with aging is an area of vital importance to identify which characteristics of aging are related to the appearance of age-associated pathologies, such as cardiovascular diseases, cancer and neurodegenerative disorders. In addition, the aging of the population is represented by the emergence of specific concomitant conditions, including loss of cognitive and physical function, polypharmacy or multimorbidity. In this sense, it is key to consider the extensive communication that exists between different tissues and organ systems. That is, changes that occur at the systemic level can have an effect at the central nervous system level, and vice versa. Several evidence have pointed out that aging manifests at the clinical level when there is an imbalance between cell damage and compensatory mechanisms. However, it is evident that this process, as well as the susceptibility to multimorbidity, affects individuals in a heterogeneous manner. This individual variability can be explained by the interaction among different biological factors, such as genetics or biological sex, and external factors, such as the environment, diet or socioeconomic determinants. In particular, the role of biological sex and gender in different pathologies, prognosis and response to treatments has been increasingly recognized. However, the inclusion of sex (and gender) as a variable still represents a need in clinical and preclinical research. Performing aging studies in human patients presents several obstacles. In this sense, the use of experimental models is very useful in pre-clinical phases and can help to understand the nature of the mechanisms underlying aging and how their interactions may predispose to pathology. In recent years, the Octodon degus (O. degus) has been proposed as a relevant tool in biomedical research. Unlike traditional rodents, the O. degus is diurnal and shows several biological characteristics similar to humans, including the development of some pathological traits associated with human aging. Among them, it has been evidenced the spontaneous appearance of pathological features such as beta-amyloid plaques and phosphorylated tau protein deposits, as well as postsynaptic dysfunction. Likewise, there is a high degree of homology with the most frequent neurodegenerative disease-related proteins (beta-amyloid, tau, alpha-synuclein and APOE). In addition, some age-related changes have been described in this model, such as astrocytic activation and oxidative stress markers, neuronal apoptosis, white matter changes similar to those of human aging, cognitive and behavioral dysfunction, type II diabetes, cataracts, retinal alterations and circadian rhythm changes. For all these reasons, this model represents a promising alternative to reproduce the multimorbidity scenario found in human aging. However, several aspects of the O. degus biology have not been characterized yet. With this in mind, the main objective of this thesis was the characterization of the O. degus as a natural model of aging by exploring systemic and brain changes along aging, as well as their interaction, including sex as an experimental variable. For this purpose, studies were performed on a total of 110 animals aged from 6 months old to 7 years old, which were divided according to age, sex or treatments. The data presented in this thesis are the result of the combination of in vivo analyses (plasma analytes, cardiac function and behavior), with the post mortem evaluation in different brain areas of neuroinflammatory processes, changes in lipid composition, lipid peroxidation and neuronal death. The first block of results of this work provides the sex-specific values of the biochemical profile in the blood of O. degus during aging. The analytes determined allowed us to examine the general metabolism, hepatic, renal and pancreatic functions, oxidation and inflammatory status. We found that most parameters were significantly altered in aged animals, with differences between males and females. The analytes analyzed indicated that these animals develop hepatic, renal and pancreatic dysfunction associated with aging. Also, plasma oxidation and inflammation levels were significantly increased in older animals compared to younger animals. Differences between males and females were also found along aging, specially in the analytes related to general and liver, muscle, and kidney metabolism, to redox-status or to inflammatory status. The biggest differences were related to oxidative status, suggesting higher oxidation in males versus females. Due to the high inter-individual variability of the data, especially accentuated in the older groups, the statistical analyses did not show significant differences in some parameters, such as glucose levels or inflammation indicators. This situation is of great interest since, taking into account that the animals in this study are not genetically identical and that they have been maintained in the same environmental conditions, only some of them are susceptible to develop sub-clinical pathological states that may predispose to the development of chronic diseases associated with aging. The second block of results shows the study of in vivo cardiac function evaluated by electrocardiography. In this section, the normal ranges for the heart rate, duration and voltage of the electrocardiogram waves and intervals, as well as electrical axis deviation, were determined. The statistical analysis revealed that the parameters that showed the greatest differences according to sex were the higher incidence of arrhythmias and greater deviation of the electrical axis of the heart in males than in females. Likewise, some electrocardiogram modifications were detected when comparing the different ages. Heart rate decreased significantly at older ages, with males being more affected than females. QRS complex duration was significantly increased in females as they aged, but not in males. Finally, the QT interval duration of younger females was significantly shorter than that of males of the same age, while in the senile stage this situation was reversed. Therefore, the data obtained showed that O. degus develop spontaneous cardiac alterations associated with aging that differ between males and females, adding value to this model for use as a natural model for investigations of the cardiovascular system. Thirdly, we analyzed the cognitive impairment associated with aging with a sex perspective, and its possible relationship with the neuroinflammatory status (microglia and astrocytes) in the dorsal hippocampus. Considering the effect of age, aged O. degus (>4 years) showed a very significant cognitive impairment when they were compared to young animals. Interestingly, when possible differences associated with the sex were investigated, we found that they were significant in the aged animals: during the training sessions, the aged females showed a better performance than the aged males, which was reversed on the day of the final test. Post mortem studies revealed that, in all dorsal hippocampal subareas analyzed, neuroinflammation was significantly increased in older animals, being the basal immunolabeling levels for microglia and astrocytes higher in males than in females. Correlation analyses indicated that increased neuroinflammation is related to worse cognitive performance, especially in the dentate gyrus and Cornu Ammonis subfield 1. The information derived from these studies characterizes for the first time age-associated cognitive decline in O. degus and its relationship to neuroinflammation in the dorsal hippocampus, with a component of inter-individual variability. The fourth block of results corresponds to the analysis of the lipid composition in the brain of O. degus during aging, in both males and females. For this purpose, four brain areas were analyzed: prefrontal cortex (PFC), striatum, cortex and cerebellum. Analysis of total lipid extracts showed that changes in lipid species in the PFC, striatum and cortex were more influenced by the age of the animals than by their sex, while in cerebellum both variables influenced more significantly the lipid composition. The changes observed during aging were region-specific, those in glycosphingolipids being common to all regions. The greatest sex-associated differences were found in gangliosides at all ages, while sphingomyelin and sulfatides were significantly different when comparing males and females of senile age. Finally, given its key role in spatial memory circuits, lipid peroxidation (POL) was analyzed in the PFC. We found that it was significantly increased along aging, males showing significant higher levels of POL than females. In addition, higher POL significantly correlated with worse cognitive performance. On the one hand, these results represent a first piece of information in the brain lipid characterization of this model. On the other hand, these data support the inclusion of sex as a variable to understand differential age-associated neurodegeneration, as well as the higher prevalence of certain diseases such as Alzheimer's disease. Finally, we validated the use of O. degus as a model of experimental Parkinsonism based on 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro-pyridine (MPTP) intoxication. MPTP intoxicated animals showed dysregulation of blood glucose levels, together with motor and cognitive alterations. Post-mortem analysis revealed a very significant loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) and in the ventral tegmental area (VTA), although dopaminergic terminals were not altered. Similarly, a highly significant reduction of noradrenergic neurons in the locus coeruleus (LC) was detected in MPTP-intoxicated animals. These findings were accompanied by a significant increase in microglial and astroglial response in the ventral midbrain (SNpc and VTA), striatum, dorsal hippocampus and LC of parkinsonized animals. These results demonstrate, for the first time, that O. degus is sensitive to MPTP-induced neurotoxicity, and therefore it is proposed as a suitable model for the study of experimental Parkinsonism beyond the motor circuits. In summary, this research represents a reasonable contribution to the scientific community in different aspects. On the one hand, a longitudinal study of the present dimensons considering both males and females in the O. degus had never been done before. First place, it provides validation of different experimental procedures and protocols in this species. Second place, the results presented in this thesis contribute to a better characterization of the O. degus, providing a starting point for future studies in the field of physiopathology and guidelines for veterinary care to early diagnosis and monitorization. On the other hand, the findings obtained support the validity of this species as a unique tool for aging research in the context of multimorbidity, possesing similarities with humans that are not present in other preclinical models. In additionally, the sex-related differences found increase the value of this model, since it offers the possibility of approaching different scientific questions from the sex perspective. Finally, the results derived from the present project set the basis for future studies that focus both in the better characterization of the model and in the individual susceptibility to different age-associated disorders considering the sex differences.
15-giu-2023
L'aspettativa di vita a livello globale è aumentata drasticamente nell'ultimo secolo, con il conseguente aumento della percentuale di persone con più di 65 anni. Purtroppo, l’aumento della longevità non è stato accompagnato da un aumento degli anni di "vita libera dalla malattia". Al contrario, l'incidenza e l'impatto (sociale ed economico) delle malattie legate all'età sono aumentati in parallelo. Per tutti questi motivi, lo studio dei meccanismi associati all'invecchiamento è un'area di vitale importanza per identificare quali caratteristiche dell’invecchiamento sono correlate alla comparsa di patologie associate all'età, come le malattie cardiovascolari, il cancro e i disturbi neurodegenerativi. Inoltre, l'invecchiamento della popolazione è caratterizzato dall’insorgenza di specifiche condizioni concomitanti, tra cui la perdita di funzioni cognitive e fisiche, la politerapia o la multimorbilità. A questo proposito, è fondamentale considerare l'ampia comunicazione che esiste tra diversi tessuti e sistemi di organi. In altre parole, i cambiamenti che si verificano a livello sistemico possono avere un effetto a livello del sistema nervoso centrale e vice versa. È dimostrato che l'invecchiamento si manifesta a livello clinico quando c'è uno squilibrio tra il danno cellulare e i meccanismi di compensazione. È evidente, però, che questo processo e la predisposizione alla multimorbilità si manifestano in modo eterogeneo tra diversi individui. Questa variabilità individuale appare come il risultato dell'interazione tra diversi fattori biologici, come la genetica o il sesso biologico, e fattori esterni, come l'ambiente, la dieta o i fattori di condizionamento socioeconomici. In particolare, negli ultimi decenni è stato sempre più riconosciuto il ruolo del sesso biologico e del genere nella comparsa di diverse patologie, nella prognosi e nella risposta ai trattamenti. Nonostante ciò, l'inclusione del sesso (e del genere) come variabile rappresenta ancora una necessità nella ricerca clinica e preclinica. La ricerca sull'invecchiamento nei pazienti umani presenta degli ostacoli. In questo senso, l'uso di modelli sperimentali è molto utile nelle fasi precliniche e può aiutare a comprendere la natura dei meccanismi alla base dell'invecchiamento e come le sue interazioni possano predisporre alla patologia. Negli ultimi anni, l'Octodon degus (O. degus) è stato proposto come modello importante per la ricerca biomedica. A differenza dei roditori tradizionali, l’O. degus è diurno e presenta svariate caratteristiche biologiche simili all'uomo, compreso lo sviluppo di alcuni tratti patologici associati all'invecchiamento umano; tra questi, sono stati descritti la comparsa spontanea di placche di beta-amiloide e depositi di proteina tau fosforilata e disfunzioni postsinaptiche. Esiste anche un elevato grado di omologia con le più comuni proteine associate alle malattie neurodegenerative (beta-amiloide, tau, alpha-sinucleina e APOE). Inoltre, in questo modello sono stati descritti alcuni cambiamenti legati all'età, come attivazione astrocitaria e marcatori dello stress ossidativo, apoptosi neuronale, alterazioni della materia bianca simili a quelle dell'invecchiamento umano, disfunzioni cognitive e comportamentali, diabete di tipo II, cataratta, alterazioni della retina e cambiamenti del ritmo circadiano. Pertanto, questo modello rappresenta un'alternativa promettente per riprodurre lo scenario di multimorbilità che si riscontra nell'invecchiamento umano. Tuttavia, diversi aspetti della biologia dell’O. degus non sono stati caratterizzati ancora. Con queste premesse, l'obiettivo principale di questa tesi è stato quello di utilizzare il modello di invecchiamento naturale O. degus per esplorare i cambiamenti sistemici e cerebrali che si verificano con l'età, nonché la loro interazione, tenendo conto dell’influenza del sesso. A tal fine, sono stati condotti studi su un totale di 110 animali di età compresa tra i 6 mesi e i 7 anni, suddivisi per età, sesso o trattamento. I dati presentati in questa tesi sono il risultato della combinazione dell’analisi in vivo (analiti plasmatici, funzione cardiaca e comportamento), con la valutazione post mortem in diverse aree cerebrali dei processi neuroinfiammatori, cambiamenti nella composizione lipidica, perossidazione lipidica e morte neuronale. La prima parte dei risultati di questo lavoro comprende l’analisi del profilo biochimico specifico del sesso nel sangue di O. degus durante l'invecchiamento. Gli analiti studiati ci hanno permesso di esaminare il metabolismo generale, le funzioni epatiche, renali e pancreatiche, lo stato ossidativo e infiammatorio. Abbiamo riscontrato che la maggior parte dei parametri era significativamente alterata negli animali invecchiati, con differenze tra machi e femmine. In particolare, i livelli di proteine totali, colesterolo e calcio sono risultati significativamente più elevati negli O. degus anziani rispetto a quelli più giovani. Gli analiti analizzati hanno indicato che questi animali sviluppano disfunzioni epatiche, renali e pancreatiche associate all'invecchiamento. Inoltre, i livelli di ossidazione e infiammazione plasmatica sono risultati significativamente più elevati negli animali anziani rispetto a quelli giovani. Nell’invecchiamento, differenze legate al sesso sono state trovate, soprattutto nei marcatori del metabolismo epatico, muscolare e renale, negli stati redox e infiammatori. Le differenze maggiori sono state riscontrate nello stato ossidativo, con livelli più elevati nei maschi rispetto alle femmine. A causa dell'elevata variabilità interindividuale dei dati, soprattutto nei gruppi più anziani, le analisi statistiche non hanno mostrato differenze significative in alcuni parametri, tra cui i livelli di glucosio o gli indicatori di infiammazione. Questa situazione è di grande interesse poiché, tenendo conto che gli animali di questo studio non sono geneticamente identici e che sono stati tenuti in condizioni ambientali identiche, solo alcuni di essi sono suscettibili allo sviluppo di stati patologici sub-clinici che possono predisporre all’insorgenza di malattie croniche associate all'invecchiamento. Il secondo blocco di risultati è relativo allo studio della funzione cardiaca in vivo, valutata mediante elettrocardiografia. In questa sezione sono stati determinati gli intervalli di normalità per la frequenza cardiaca, la durata e il voltaggio delle onde e degli intervalli dell’elettrocardiogramma, nonché la deviazione dell'asse elettrico. L'analisi statistica ha rivelato che i parametri che mostravano le maggiori differenze in base al sesso sono stati la maggiore incidenza di aritmie e la maggiore deviazione dell'asse elettrico del cuore nei maschi rispetto alle femmine. Inoltre, sono state rilevate alcune modifiche dell'elettrocardiogramma nel confronto tra le diverse età. La frequenza cardiaca è diminuita in modo significativo negli animali di età più avanzata, con i maschi più colpiti delle femmine. La durata del complesso QRS è aumentata significativamente nelle femmine con l'avanzare dell'età, ma non nei maschi. Infine, la durata dell'intervallo QT delle femmine più giovani era significativamente più breve rispetto a quello dei maschi della stessa età, mentre nella fase senescente la situazione era invertita. Pertanto, i dati ottenuti mostrano che O. degus sviluppa alterazioni cardiache spontanee associate all'invecchiamento che differiscono tra maschi e femmine, il che aggiunge valore al suo potenziale utilizzo come modello naturale per le indagini sul sistema cardiovascolare. In terzo luogo, abbiamo analizzato il deterioramento cognitivo associato all'invecchiamento in modo genere-dipendente e la sua possibile relazione con lo stato neuroinfiammatorio (microglia e astrociti) nell'ippocampo dorsale. Durante tutte le fasi sperimentali gli O. degus anziani (>4 anni) hanno mostrato un declino cognitivo molto significativo rispetto agli animali giovani. È interessante notare che, indagando le possibili differenze associate al sesso degli animali, abbiamo riscontrato che queste, pur non essendo state riscontrate negli animali più giovani, erano significative in quelli più anziani. Pertanto, nelle varie sessioni di allenamento, le femmine hanno mostrato una performance migliore rispetto ai maschi; la situazione si è invertita nel giorno del test finale. Gli studi post mortem hanno rivelato che, in tutte le sotto-aree dell'ippocampo dorsale analizzate, la neuroinfiammazione aumentava significativamente negli animali più anziani, con livelli di immunomarcatura basale per microglia e astrociti più elevati nei maschi rispetto alle femmine. Le analisi di correlazione hanno indicato che l'aumento della neuroinfiammazione è correlato a prestazioni cognitive peggiori, soprattutto nelle aree del giro dentato e del Cornu Ammonis (regione 1). Le informazioni derivate da questi studi dimostrano per la prima volta il declino cognitivo associato all'età in O. degus e la sua relazione con la neuroinfiammazione nell'ippocampo dorsale, con una componente di variabilità interindividuale. Il quarto blocco di risultati corrisponde all'analisi della composizione lipidica nel cervello di O. degus durante l'invecchiamento, in relazione al sesso. A tal fine, sono state analizzate quattro aree cerebrali: corteccia prefrontale (CPF), striato, corteccia e cervelletto. L'analisi degli estratti lipidici totali ha mostrato che le variazioni delle specie lipidiche nella CPF, nello striato e nella corteccia erano più influenzate dall'età degli animali che dal sesso, mentre nel cervelletto entrambe le variabili influenzavano la composizione lipidica. I cambiamenti osservati durante l'invecchiamento sono specifici per ogni regione, mentre quelli dei glicosfingolipidi sono comuni a tutte le regioni. Le maggiori differenze legate al sesso sono state riscontrate nei gangliosidi, a tutte le età, mentre la sfingomielina e i solfatidi sono risultati significativamente diversi nel confronto tra maschi e femmine in età senile. Infine, dato il suo ruolo chiave nei circuiti della memoria spaziale, nella CPF è stata analizzata la perossidazione lipidica (POL), di cui ne è stato riscontrato un aumento significativo durante l'invecchiamento e nel confronto tra maschi e femmine. Inoltre, una POL più elevata correlava in modo significativo con prestazioni cognitive peggiori. Questi risultati, da un lato rappresentano una prima informazione nella caratterizzazione dei lipidi cerebrali di questo modello, dall’altro confermano che il sesso costituisce un’ulteriore variabile per comprendere il diverso grado di neurodegenerazione associata all'età, nonché la diversa incidenza di alcune malattie, come il morbo di Alzheimer, in maschi e femmine. Infine, O. degus è stato validato come modello di parkinsonismo sperimentale basato sull'intossicazione da 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Gli animali intossicati da MPTP hanno mostrato una disregolazione dei livelli di glucosio nel sangue, oltre a disturbi motori e cognitivi. L'analisi post mortem ha rivelato una perdita notevolmente significativa di neuroni dopaminergici nella Substantia Nigra pars compacta (SNpc) e nell'area tegmentale ventrale (ATV), sebbene i terminali dopaminergici non fossero alterati. Analogamente, negli animali intossicati da MPTP è stata rilevata una riduzione altamente significativa dei neuroni noradrenergici nel locus coeruleus (LC). Questi risultati sono stati accompagnati da un aumento significativo delle risposte microgliali e astrogliali nel mesencefalo ventrale (SNpc e ATV), nello striato, nell'ippocampo dorsale e nel LC degli animali “parkinsonizzati”. Questi risultati dimostrano, per la prima volta, che O. degus è sensibile alla neurotossicità indotta dall'MPTP, rendendolo un modello adatto per lo studio del parkinsonismo sperimentale, al di là della compromissione motoria. In conclusione, questa ricerca offre un contributo ragionevole alla comunità scientifica sotto diversi aspetti. Da un lato, uno studio longitudinale di questa portata che considera maschi e femmine in O. degus non è mai stato condotto prima. In primo luogo, fornisce la convalida di protocolli che non erano stati utilizzati in precedenza in questa specie. In secondo luogo, i risultati presentati in questa tesi contribuiscono a una migliore caratterizzazione di O. degus, fornendo un punto di partenza per futuri studi sulla fisiopatologia e linee guida veterinarie per la diagnosi precoce e il monitoraggio delle alterazioni. D'altra parte, i risultati ottenuti confermano che questa specie è uno strumento unico per la ricerca sull'invecchiamento nel contesto della multimorbilità, con somiglianze con l'uomo che non sono presenti in altri modelli preclinici. Inoltre, le differenze associate al sesso riscontrate aumentano il valore di questo modello, in quanto offre la possibilità di affrontare studi futuri da una prospettiva sessuale in fisiologia e patologia. Infine, i risultati presentati in questa tesi pongono le basi per studi futuri che si concentrano sia sull'ulteriore caratterizzazione del modello sia sulla suscettibilità individuale allo sviluppo di malattie associate all'età, con la possibilità di studiare le differenze di sesso.
La esperanza de vida a nivel mundial ha experimentado un ascenso dramático en el último siglo, resultando en un aumento de la proporción de personas mayores de 65 años. Lamentablemente, este aumento en la longevidad no ha estado acompañado por un incremento en los años de “vida libre de enfermedades”, sino que la incidencia y el impacto (social y económico) de las enfermedades asociadas a la edad se han visto aumentados en paralelo. Por todo ello, el estudio de los mecanismos asociados al envejecimiento es un área de vital importancia para identificar qué características propias del envejecimiento se relacionan con la aparición de patologías asociadas a la edad, tales como las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y los trastornos neurodegenerativos. Además, el envejecimiento de la población está representado por la aparición de condiciones concomitantes específicas, incluyendo la pérdida de funciones cognitiva y física, la polifarmacia o la multimorbilidad. En este sentido, es clave considerar la extensa comunicación que existe entre los diferentes tejidos y sistemas de órganos. Es decir, los cambios que se producen a nivel sistémico pueden tener un efecto a nivel del sistema nervioso central, y viceversa. Diversas evidencias han señalado que el envejecimiento se manifiesta a nivel clínico cuando existe un desbalance entre daños celulares y mecanismos compensatorios. Sin embargo, resulta evidente que este proceso, así como la susceptibilidad a la multimorbilidad, se manifiestan de una forma heterogénea entre individuos. Esta variabilidad individual aparece como resultado de la interacción entre diferentes factores biológicos, como la genética o el sexo biológico, y externos, como el ambiente, la dieta o los condicionantes socioeconómicos. En particular, el papel del sexo biológico y el género en la aparición de diferentes patologías, pronóstico y respuesta a tratamientos ha sido reconocido de forma creciente. A pesar de ello, la inclusión del sexo (y el género) como variable todavía representa una necesidad en las investigaciones clínica y preclínica. La investigación del envejecimiento en pacientes humanos presenta obstáculos. En este sentido, el uso de modelos de experimentación es muy útil en fases pre-clínicas y puede ayudar a comprender la naturaleza de los mecanismos que subyacen al envejecimiento, y cómo sus interacciones pueden predisponer a la patología. En los últimos años, el Octodon degus (O. degus) se ha propuesto como una herramienta relevante en la investigación biomédica. A diferencia de los roedores tradicionales, el O. degus es diurno y muestra diversas características biológicas similares a los humanos, incluyendo el desarrollo de rasgos patológicos asociados al envejecimiento humano. Entre ellos, se ha descrito la aparición espontánea de placas beta-amiloides y depósitos de proteína tau fosforilada, así como la disfunción postsináptica. Asimismo, existe un alto grado de homología con las proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas más frecuentes (beta-amiloide, tau, alfa-sinucleína y APOE). Además, se han descrito algunos cambios relacionados con la edad en este modelo, como activación astrocítica y marcadores de estrés oxidativo, apoptosis neuronal, cambios en la sustancia blanca similares a aquéllos de envejecimiento humano, disfunción cognitiva y comportamiento, diabetes tipo II, cataratas, alteraciones retinianas y cambios del ritmo circadiano. Por todo ello, este modelo representa una alternativa prometedora para reproducir el escenario de multimorbilidad que se encuentra en el envejecimiento humano. Sin embargo, diversos aspectos de la biología del O. degus no se han caracterizado aún. Teniendo esto en cuenta, el principal objetivo de esta tesis fue caracterizar el O. degus como modelo de envejecimiento natural explorando cambios sistémicos y cerebrales con la edad, así como su interacción, incluyendo el sexo biológico como variable experimental. Para ello, los estudios se realizaron en un total de 110 animales con edades comprendidas entre los 6 meses y los 7 años, que fueron divididos según su edad, sexo o tratamientos. Los datos presentados en esta tesis son el resultado de la combinación de análisis in vivo (analitos plasmáticos, función cardíaca y comportamiento), con la evaluación post mortem en distintas áreas cerebrales para determinar procesos neuroinflamatorios, cambios en composición lipídica, peroxidación lipídica y muerte neuronal. El primer bloque de resultados de este trabajo recoge los valores del perfil bioquímico en sangre del O. degus específicos de sexo durante el envejecimiento. Los analitos estudiados permitieron examinar el metabolismo general, las funciones hepática, renal y pancreática, los estados oxidativo e inflamatorio. Encontramos que la mayoría de parámetros estaban significativamente alterados en los animales añosos, con diferencias entre machos y hembras. Los analitos analizados indicaron que estos animales desarrollaban disfunción hepática, renal y pancreática asociada al envejecimiento. Asimismo, los niveles de oxidación e inflamación plasmáticos estaban significativamente aumentados en los animales añosos en comparación a los jóvenes. A lo largo del envejecimiento se encontraron diferencias entre machos y hembras, especialmente en los marcadores de metabolismo de hígado, músculo y riñón, y a los estados redox e inflamatorio. Las mayores diferencias se encontraron en el estado oxidativo, con niveles más elevados en machos que en hembras. Debido a la elevada variabilidad inter-individual que presentaron los datos, especialmente acentuada en los grupos de mayor edad, los análisis estadísticos no mostraron diferencias significativas en algunos parámetros, como es el caso de los niveles de glucosa o indicadores de inflamación. Esta situación es de gran interés ya que, teniendo en cuenta que los animales de este estudio no son genéticamente idénticos y que han sido mantenidos en idénticas condiciones ambientales, sólo algunos de ellos fueron susceptibles de desarrollar estados patológicos sub-clínicos que pueden predisponer al desarrollo de enfermedades crónicas asociadas al envejecimiento. El segundo bloque de resultados corresponde al estudio de la función cardíaca in vivo, evaluada mediante electrocardiografía. En esta sección se determinaron los rangos de valores para frecuencia cardíaca, duración y voltaje de los diferentes componentes del electrocardiograma, así como la desviación del eje eléctrico. El análisis estadístico reveló que los parámetros que mostraron mayores diferencias según el sexo fue la incidencia de arritmias y desviación del eje eléctrico del corazón, ambos superiores en machos. Asimismo, se detectaron algunas modificaciones del electrocardiograma al comparar las diferentes edades. La frecuencia cardíaca disminuyó significativamente en las edades más avanzadas, mostrándose los machos más afectados que las hembras. La duración del complejo QRS se vio significativamente aumentada en hembras a medida que envejecían, pero no en machos. Por último, la duración del intervalo QT de las hembras más jóvenes era significativamente inferior a la de los machos de la misma edad, mientras que en la etapa senil esta situación se vio invertida. Por todo ello, los datos obtenidos muestran que el O. degus desarrolla alteraciones cardíacas espontáneas asociadas al envejecimiento que difieren entre machos y hembras, lo que añade valor a este modelo para su uso como modelo natural para investigaciones del sistema cardiovascular. En tercer lugar, analizamos el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento con perspectiva de sexo, y su posible relación con el estado neuroinflamatorio en el hipocampo dorsal. A lo largo de todo el proceso experimental, los O. degus envejecidos (>4 años) mostraron un deterioro cognitivo muy significativo al compararlos con los animales jóvenes. Interesantemente, al investigar las posibles diferencias asociadas al sexo, encontramos que éstas, si bien no se encontraron en los animales más jóvenes, fueron significativas en los animales añosos. De esta forma, durante las sesiones de entrenamiento, las hembras añosas mostraron un mejor rendimiento que los machos que se vio invertido el día del test final. Los estudios post mortem revelaron que, en todas las subáreas del hipocampo dorsal analizadas, la neuroinflamación estaba significativamente aumentada en los animales de mayor edad, siendo los niveles basales de inmunomarcaje para microglía y astrocitos superiores en los machos. Los análisis de correlaciones indicaron que el aumento de neuroinflamación se relaciona con un peor rendimiento cognitivo, especialmente en las áreas de giro dentado y Cornu Ammonis 1. La información derivada de estos estudios caracteriza por primera vez el deterioro cognitivo asociado a la edad en el O. degus y su relación con la neuroinflamación en hipocampo dorsal, con una componente de variabilidad inter-individual. El cuarto bloque de resultados corresponde a los análisis de la composición lipídica en el cerebro del O. degus durante el envejecimiento, con perspectiva de sexo. Para ello, se analizaron cuatro áreas cerebrales: corteza prefrontal (CPF), estriado, corteza y cerebelo. El análisis de los extractos lipídicos totales mostró que los cambios en las especies lipídicas en la CPF, estriado y corteza se vieron más influidos por la edad de los animales que por el sexo, mientras que en cerebelo ambas variables influyeron en la composición lipídica. Los cambios observados durante el envejecimiento fueron específicos de cada región, aunque los glicoesfingolípidos aparecieron alterados en todas ellas. Las mayores diferencias asociadas al sexo de los animales se encontraron en los gangliósidos en todas las edades, mientras que la esfingomielina y las sulfatidas fueron significativamente diferentes al comparar machos y hembras de edades seniles. Por último, dado su papel clave en los circuitos de memoria espacial, se analizó la peroxidación lipídica (POL) en CPF. En relación a esta última, se encontró significativamente aumentada durante el envejecimiento, mostrando los machos niveles significativamente superiores de POL que las hembras. Además, una mayor POL correlacionó de manera significativa con un peor rendimiento cognitivo. Por un lado, estos resultados suponen una primera pieza de información en la caracterización lipídica cerebral de este modelo. Por otro, estos datos apoyan la inclusión del sexo como variable para entender la neurodegeneración diferencial asociada a la edad, así como la mayor prevalencia de patologías como la enfermedad de Alzheimer. Finalmente, se validó uso del O. degus como modelo de Parkinsonismo experimental basado en la intoxicación con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridina (MPTP). Los animales intoxicados con MPTP mostraron una desregulación de los niveles de glucosa en sangre, junto con alteraciones motoras y cognitivas. El análisis post mortem reveló una pérdida muy significativa de neuronas dopaminérgicas en la Sustancia Negra pars compacta (SNpc) y en el área tegmental ventral (ATV), aunque las terminales dopaminérgicas no se vieron alteradas. Del mismo modo, se detectó una reducción muy significativa de las neuronas noradrenérgicas del locus coeruleus (LC) en los animales intoxicados con MPTP. Estos hallazgos fueron acompañados de un aumento significativo de la respuesta microglial y astroglial en el mesencéfalo ventral (SNpc y ATV), en el estriado, en el hipocampo dorsal y en el LC de los animales parkinsonizados. Estos hallazgos demostraron, por primera vez, que el O. degus es sensible a la neurotoxicidad inducida por MPTP, por lo que apoyan a esta especie como un modelo adecuado para el estudio de Parkinsonismo experimental más allá de la afectación motora y en un contexto de multimorbilidad. Por todo ello, esta investigación supone una contribución razonable para la comunidad científica en diferentes aspectos. Por un lado, nunca antes se había realizado un estudio longitudinal de esta envergadura que considerase machos y hembras en el O. degus. En primer lugar, aporta la validación de protocolos que antes no se habían empleado en esta especie. En segundo lugar, los resultados presentados en esta tesis contribuyen a una mayor caracterización del O. degus, aportando un punto de partida para estudios futuros de fisiopatología y guías a nivel veterinario para diagnóstico precoz y monitorización de alteraciones. Por otro lado, los hallazgos obtenidos apoyan que esta especie es una herramienta única para investigación en envejecimiento en el contexto de multimorbilidad, con similitudes a los humanos que no están presentes en otros modelos preclínicos. Además, las diferencias asociadas al sexo encontradas incrementan el valor de este modelo, ya que ofrece la posibilidad de abordar futuros estudios desde una perspectiva de sexo en fisiología y patología. Por último, los resultados presentados en esta tesis asientan la base para futuros estudios que se enfoquen tanto en una mayor caracterización del modelo como de la susceptibilidad individual al desarrollo de enfermedades asociadas a la edad con la posibilidad de estudiar diferencias de sexo.
Settore BIO/10 - Biochimica
Octodon degus; aging; sex; blood; biochemistry; heart; electrocardiogram; brain; neurodegeneration; memory; cognitive decline; neuroinflammation; lipids; oxidative stress; Parkinson's disease; MPTP.
PRINETTI, ALESSANDRO ENNIO GIUSEPPE
SFORZA, CHIARELLA
Doctoral Thesis
SYSTEMIC ALTERATIONS AND BRAIN CHANGES IN PHYSIOLOGY AND PATHOLOGY. THE OCTODON DEGUS AS A MODEL OF AGING AND MULTIMORBIDITY / L. Cuenca Bermejo ; TUTORS: A. PRINETTI, M.T. HERRERO EZQUERRO ; COORDINATOR UNIMI: C. SFORZA ; COORDINATOR UNIVERSITY OF MURCIA: E. LARQUÉ DAZA. Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, 2023 Jun 15. 34. ciclo, Anno Accademico 2021.
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