NEW PLANT BREEDING TECHNIQUES AND PRIMING AS A MULTIPLE LEVEL STRATEGY FOR THE CONTROL OF DOWNY MILDEW INFECTION IN GRAPEVINE

The present thesis relates on three complementary approaches for a more sustainable control of Plasmopara viticola: cisgenesis, RNAi and plant defence priming. A brief general introduction is presented in the first chapter, touching the main aspects relative to viticulture in Europe, characteristics of the disease, new biotechnological strategies and priming of plant defence. The second chapter consists of a review article describing with detail the most recent biotechnological approaches for crop protection, including cisgenesis, genome editing, RNAi and epigenetics. In the third chapter the activities concerning cisgenesis for grapevine downy mildew resistance are reported, the study initially focuses on the induction of somatic embryogenesis from elite germplasm, optimising the cultivation of floral tissues for the generation of embryogenic calli. The resistance genes TNL2a and TNL2b belonging to the RPV3-1 locus, which confers resistance to Plasmopara viticola, were then selected for the development of cisgenic varieties, with the construction of a cisgenic vector harbouring those two genes. Finally, the chapter reports on the Agrobacterium tumefaciens transformation of embryogenic calli that are currently cultivated on selective medium, and on the future activities for the regeneration of transformed cisgenic plants. In the fourth and fifth chapters, two papers addressing different aspects related to the exploitation of plant immune system are presented: the first study aimed at clarifying the effects of arbuscular mycorrhiza priming on the grapevine growth-defence trade-off while the second study was focused on the use of alternative protection protocols for the control of downy mildew in a commercial vineyard. Particularly, in the fourth chapter “Mycorrhizal symbiosis balances rootstock-mediated growth-defence tradeoffs”, the potential benefits of an inoculum formed by two arbuscular mycorrhiza fungal species, with or without a monosaccharide addition, were evaluated on young grapevine cuttings grafted onto 1103P and SO4 rootstocks. The influence of the different treatments was assessed by combining the analysis of agronomic features with biochemical and molecular techniques. The results showed that despite the opposite behaviour of the two selected rootstocks, in mycorrhized samples the whole root microbiome is actively involved in the growth-defence trade off balance. Finally in the fifth chapter the submitted paper “Novel sustainable strategies to control Plasmopara viticola in grapevine unveil new insights on priming responses and arthropods ecology” is presented. The study addresses the reduction of fungicide consumption in viticulture and its associated risks by the exploitation of alternative protocols for the control of downy mildew infection in grapevine, compared to a standard winery protection protocol. In the first protocol, only resistance inducers were used, while the second and third protocols followed the standard protocol but substituting phosphonates with phosphorus pentoxide and Ecklonia maxima extract. The results showed that, at véraison, downy mildew incidence and severity were significantly reduced on both canopy and bunches in the plants treated with all tested protocols compared to non-treated controls. The study also revealed interesting insights about the direct effect of protocols for phosphite substitution on the crosstalk between salicylic and jasmonic acid signalling pathways. Interestingly, by priming plant defences, the resistance inducers caused a short delay in bunch ripening, involving changes in carbohydrate metabolism, regulation of defence related genes, systemic acquired resistance and reactive oxygen species detoxification. In the thesis conclusion, the main findings are then summarised for each chapter, by examining the most critical aspects and including a brief discussion on the preliminary activities that were conducted to exploit the RNAi technique for silencing two essential genes of Plasmopara viticola.

La presente tesi riguarda tre approcci complementari per un controllo più sostenibile del patogeno Plasmopara viticola: cisgenesi, RNAi e priming di difesa delle piante. Nel primo capitolo viene presentata una breve introduzione generale, toccando i principali aspetti relativi alla viticoltura in Europa, alle caratteristiche della malattia, alle nuove strategie biotecnologiche e al priming nella difesa delle piante. Nel secondo capitolo viene presentata una review che descrive in dettaglio i più recenti approcci biotecnologici per la protezione delle colture, tra cui la cisgenesi, l'editing del genoma, l'RNAi e l'epigenetica. Nel terzo capitolo sono riportate le attività relative alla cisgenesi per l’introduzione della resistenza alla peronospora nella vite, lo studio si è concentrato inizialmente sull'induzione dell'embriogenesi somatica in germoplasma d'élite, ottimizzando la coltivazione dei tessuti floreali per la generazione di calli embriogenici. I geni di resistenza TNL2a e TNL2b appartenenti al locus RPV3-1, che conferiscono resistenza a Plasmopara viticola, sono stati quindi selezionati per lo sviluppo di varietà cisgeniche, con la costruzione di un vettore cisgenico che ospita questi due geni. Viene quindi descritta la trasformazione dei calli embriogenici con i ceppi ingegnerizzati di Agrobacterium tumefaciens e le future attività per la rigenerazione di piante cisgeniche trasformate. Nel quarto e nel quinto capitolo vengono presentati due articoli che affrontano diversi aspetti legati allo sfruttamento del sistema immunitario delle piante: il primo studio mira a chiarire gli effetti del priming indotto da micorrize sul bilancio tra crescita e difesa nella vite mentre il secondo studio si concentra sull'utilizzo di protocolli di protezione alternativi per il controllo della peronospora in un vigneto commerciale. In particolare, nel quarto capitolo “Mycorrhizal symbiosis balances rootstock-mediated growth-defence tradeoffs”, sono stati valutati i potenziali benefici di un inoculo formato da due specie di micorrize arbuscolari, con o senza aggiunta di monosaccaridi, su giovani barbatelle innestate sui portainnesti 1103P e SO4. L'influenza dei diversi trattamenti è stata valutata combinando l'analisi delle caratteristiche agronomiche con tecniche biochimiche e molecolari. I risultati hanno mostrato che, nonostante il comportamento opposto dei due portainnesti selezionati, nei campioni trattati con le micorrize l'intero microbioma della radice è attivamente coinvolto nel bilanciamento dei costi/benefici tra crescita e difesa. Infine, nel quinto capitolo, viene presentato l’articolo "Novel Sustainable Strategy to control Plasmopara viticola in grapevine, unveil new insights on priming responses and artropods ecology". Lo studio affronta la riduzione del consumo di fungicidi in viticoltura e dei rischi associati attraverso lo sfruttamento di protocolli alternativi per il controllo della peronospora nella vite confrontandoli con un protocollo di protezione standard adottato da una cantina commerciale. Nel primo protocollo sono stati utilizzati solo induttori di resistenza, mentre il secondo e il terzo protocollo hanno seguito il protocollo standard ma sostituendo i fosfonati con anidride fosforica ed estratto di Ecklonia maxima. I risultati hanno mostrato che all'invaiatura l'incidenza e la gravità della peronospora in tutti i protocolli testati erano significativamente ridotte rispetto ai controlli non trattati sia sulla chioma che sui grappoli. Lo studio ha anche mostrato degli spunti interessanti sulla rimodulazione dell'acido salicilico e dell'acido jasmonico nei due protocolli per la sostituzione dei fosfiti. È interessante notare come gli induttori di resistenza attivando le difese della pianta abbiano indotto anche un breve ritardo nella maturazione dei grappoli, agendo, sul metabolismo dei carboidrati, sulla regolazione dei geni di difesa, sulla risposta sistemica acquisita e sulla disintossicazione dalle specie reattive dell’ossigeno. Nella conclusione sono quindi riassunti i principali risultati di ciascun capitolo, esaminandone gli aspetti più critici, inclusa una breve discussione delle attività preliminari che sono state condotte sull’uso dell’RNAi per il silenziamento di due geni essenziali di Plasmopara viticola.