THE ACID SPHINGOMYELINASE PATHWAY AS A PROMISING TARGET OF INFLAMMATION AND OXIDATIVE STRESS IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY

The enzyme Acid Sphingomyelinase (ASMase) plays a major role in the metabolism of sphingolipids by generating ceramide, a lipid second messenger involved in a wide range of physiological and pathological processes (Zeidan & Hannun, 2010). ASMase is activated by multiple stress stimuli, and in turn induces the production of key mediators of inflammation and oxidative stress, which are hallmarks of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) (Petrillo et al., 2017; Tidball et al., 2018). Since we recently demonstrated the involvement of ASMase in the progression of DMD, we here explored whether targeting this enzyme by administering the functional inhibitors of ASMase (FIASMAs), i.e. Fluoxetine and Sertraline (Kornhuber et al., 2010), and/or antioxidant molecules, i.e. Plumbagin, Quercetin, and N-Acetylcysteine (NAC) to mdx mice, the murine model of DMD, would be a pertinent therapeutic strategy. Both Plumbagin and Quercetin improved the muscle function compared to the mdx vehicle and reached a recovery score versus wild-type (WT) similar to NAC. This is promising as several studies support the benefits of NAC in mdx mice (de Senzi Moraes Pinto et al., 2013; Whitehead et al., 2008), here employed as a control of the efficacy of our treatment. FIASMAs failed to improve muscle function, however, the potential improvement was possibly hidden due to the behavioral effect of Fluoxetine and Sertraline, two selective serotonin reuptake inhibitors, as suggested by administering the drugs to WT mice who had a poor performance compared to the WT vehicle. All the treatments however improved muscle morphology and significantly decreased muscle damage. In parallel, the muscle regeneration was enhanced. We found that both the tested FIASMAs and Plumbagin were able to decrease ASMase activity in the diaphragm while Quercetin did not. Both FIASMAs and antioxidants reduced and modulated inflammation towards an anti-inflammatory state as evidenced by the decreased expression of the M1 macrophage markers, worsening muscle damage, in parallel with the increase in M2 macrophage markers promoting tissue repair (Madaro et al., 2019; S. A. Villalta et al., 2009). All the treatments also attenuated oxidative stress by increasing the expression of several enzymes involved in the antioxidant defense system. Only Fluoxetine and Plumbagin induced Nrf2 expression, which plays a pivotal role in both oxidative stress and inflammation, thus holding great potential in DMD therapy (Kourakis, Timpani, de Haan, et al., 2021). Similar results were obtained in an acute muscle injury model by using ASMase-KO mice, thus suggesting that the events observed in treated mdx mice are related to the decrease of ASMase activity. Indeed, ASMase ablation induced a surge of Nrf2, alleviated and modulated inflammation towards an anti-inflammatory state, leading to an improved regeneration by acting on the niche of satellite cells (Roux-Biejat et al., 2021). We provide evidence that acting on the ASMase pathway is a promising alternative therapeutic strategy to the incurable DMD. Being antidepressants, these FIASMAs could alleviate the depressive symptoms often displayed by the patient. Moreover, drug repurposing allows time- and cost-savings as the drugs are already commercially available with a known safety profile. Finally, the efficacy could potentially be improved in a synergistic/additive manner by combining a FIASMA with an antioxidant. Our results show that the most efficient ones in their class are Fluoxetine and Plumbagin.

L'enzima sfingomielinasi acida (ASMase) svolge un ruolo importante nel metabolismo degli sfingolipidi generando ceramide, un secondo messaggero lipidico coinvolto in un'ampia gamma di processi fisiologici e patologici (Zeidan & Hannun, 2010). ASMase è attivato da molteplici stimoli di stress e, a sua volta, induce la produzione di mediatori chiave dell'infiammazione e dello stress ossidativo, che sono caratteristiche distintive della distrofia muscolare di Duchenne (DMD) (Petrillo et al., 2017; Tidball et al., 2018). Dato che abbiamo recentemente dimostrato il coinvolgimento di ASMase nella progressione della DMD, abbiamo quindi investigato se inibire l’attività di questo enzima, somministrando degli inibitori funzionali di ASMase (FIASMA), ovvero Fluoxetina e Sertralina (Kornhuber et al., 2010), e/o molecole antiossidanti, ovvero Plumbagina, Quercetina e N-Acetilcisteina (NAC), ai topi mdx, il modello murino della DMD, possa essere una valida strategia terapeutica. Sia la Plumbagina che la Quercetina hanno migliorato la funzione muscolare dei topi mdx rispetto al veicolo e hanno raggiunto un recovery score, rispetto ai wild-type (WT), simile a quello di NAC. Ciò è promettente poiché molti studi supportano i benefici di NAC nei topi mdx (de Senzi Moraes Pinto et al., 2013; Whitehead et al., 2008), qui usato come controllo dell'efficacia del nostro trattamento. FIASMA non ha avuto successo nel miglioramento della funzione muscolare, che comunque, è stato probabilmente mascherato dall'effetto del comportamento di Fluoxetina e Sertralina, che appartengono alla classe degli inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina, come suggerito dalla somministrazione degli stessi farmaci ai topi WT, che presentavano una ridotta performance rispetto ai topi WT non trattati. Tutti i trattamenti hanno comunque migliorato la morfologia muscolare e ridotto significativamente il danno muscolare. Parallelamente, è stata potenziata la rigenerazione muscolare. Abbiamo inoltre trovato che sia i FIASMA testati che la Plumbagina sono in grado di ridurre l'attività di ASMase nel diaframma, mentre la Quercetina non ha prodotto nessun effetto in tal senso. Sia i FIASMA che gli antiossidanti hanno ridotto e modulato l'infiammazione verso uno stato antinfiammatorio, come evidenziato dalla ridotta espressione di marcatori dei macrofagi M1, che peggiorano il danno muscolare, e parallelamente dall'aumento dei marcatori dei macrofagi M2, che promuovono la riparazione dei tessuti (Madaro et al., 2019; S. A. Villalta et al., 2009). Tutti i trattamenti hanno inoltre attenuato lo stress ossidativo, aumentando l'espressione di diversi enzimi coinvolti nel sistema di difesa antiossidante. Solo Fluoxetina e Plumbagina sono state capaci di indurre l'espressione di Nrf2, proteina che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dello stress ossidativo e dell'infiammazione con un grande potenziale nella terapia della DMD (Kourakis, Timpani, de Haan, et al., 2021). Risultati simili sono stati ottenuti in un modello di danno muscolare acuto, utilizzando topi ASMasi-KO, suggerendo così che gli eventi osservati nei topi mdx trattati farmacologicamente possano essere correlati alla diminuzione dell'attività di ASMasi. Infatti, in assenza di ASMase si è osservato un aumento di Nrf2 a seguito del danno muscolare ed una riduzione dell'infiammazione con conseguente miglioramento della rigenerazione da parte delle cellule satelliti muscolari (Roux-Biejat et al., 2021). In questo lavoro forniamo delle prove sull’inibizione della ASMase come una terapia alternativa promettente contro l’incurabile DMD. Essendo degli antidepressivi, questi FIASMA possono alleviare i sintomi depressivi spesso osservati nei pazienti. Inoltre, il riposizionamento di farmaci già approvati e con un noto profilo di sicurezza consentirebbe di risparmiare tempo e denaro per la loro nuova approvazione. Infine, l'efficacia delle molecole testate potrebbe potenzialmente essere migliorata in modo sinergico/additivo combinando un FIASMA con un’antiossidante. I nostri risultati mostrano che i più efficaci nelle loro rispettive classi sono Fluoxetina e Plumbagina.