HES CELLS TO STUDY EARLY NEURODEVELOPMENT IN HUNTINGTON'S DISEASE

Huntington Disease (HD) is a genetic neurodegenerative disease caused by a CAG expansion in the gene encoding for the Huntingtin (HTT) protein. The progressive death and atrophy of specific striatal GABAergic projection neurons named Medium Spiny Neurons (MSNs) lead to motor, cognitive and psychiatric dysfunctions in HD patients. Several studies are pointing to the crucial functions of HTT during early development, advocating to a developmental component of HD. Based on these observations, we employed the isogenic series of HD human embryonic stem cells (RUES2) to study the effects of mutant HTT on neuronal differentiation in a fixed genetic background. Firstly, by exposing the control RUES2 cell line to ventral telencephalic differentiation we observed the propensity of the cells to differentiate toward the medial ganglionic eminence (MGE) compared to other human embryonic stem cell (hESC) lines. Moreover, HD RUES2 displayed aberrant MGE cell fate acquisition. Also, these cells recapitulate known HD phenotypes, such as reduced expression of BDNF and NEUROD1, and increased cleavage of N-cadherin. In particular, HD lines exhibit a defect in the transition from pluripotency toward neuroectodermal fate as documented by the persistency of the pluripotent marker OCT4 and by reduced upregulation of the neuroectodermal marker PAX6. Considering the fundamental function of Polycomb group proteins (PcGs) in regulating cell fate identity and differentiation and the crucial role of epigenetics in HD pathogenesis, we started investigating whether these complexes were affected in our cell system. Differences in the number and size of the three-dimensional PcG foci structures emerged between control and HD lines, suggesting a potential link between HTT and these epigenetic complexes. Moreover, level of H3K9me3 histone modification was affected in HD lines during the differentiation. Overall, these preliminary data suggest that the presence of the mutation in the HD gene causes alterations in the regulation of both constitutive and facultative heterochromatin already in pluripotency. This hypothesis will be further tested through experiments of ChIP-seq analysis, in which we expect to identify target genes whose expression may be dysregulated in the early stages of neural development.

La Corea di Huntington (MH) è una malattia neurodegenerativa genetica causata dall’espansione del tratto CAG nel gene codificante la proteina Huntingtina (HTT). La morte progressiva di specifici neuroni GABAergici striatali, chiamati Medium Spiny Neurons (MSNs) è responsabile delle disfunzioni motorie, cognitive e psichiatriche dei pazienti MH. Numerosi studi stanno evidenziando le cruciali funzioni dell'HTT durante le prime fasi dello sviluppo, sostenendo la presenza di una componente evolutiva della MH. Abbiamo quindi impiegato la serie isogenica di linee hES RUES2 HD per studiare gli effetti di diverse lunghezze CAG patologiche in un background genetico costante. Innanzitutto, esponendo la linea RUES2 al differenziamento telencefalico ventrale abbiamo osservato la propensione a differenziare verso l'eminenza gangliare mediale (MGE). Inoltre, la linea HD risulta incapace di acquisire un destino MGE. Queste linee inoltre ricapitolano fenotipi HD noti, come la ridotta espressione di BDNF e NEUROD1 e una maggiore scissione della proteina sinaptica N-cadherina. In particolare, è risultato alterato il passaggio dalla pluripotenza al destino neuroectodermico; poiché, le linee HD mostrano una persistente espressione di OCT4 insieme a ridotti livelli del marker neuroectodermico PAX6. Considerando il ruolo fondamentale delle proteine dei gruppi Polycomb (PcG) nella regolazione dell'identità cellulare e del differenziamento, abbiamo caratterizzato questi complessi nel nostro sistema cellulare. Sono emerse differenze nel numero e nella dimensione delle strutture tridimensionali dei PcG tra la linea controllo e HD, suggerendo un potenziale legame tra la proteina HTT e questi complessi epigenetici. Inoltre, le linee HD RUES2 presentano un’alterazione anche a livello della modificazione istonica H3K9me3 durante il differenziamento. In conclusione, questi dati preliminari hanno evidenziato modificazioni nella regolazione dell'eterocromatina costitutiva e facoltativa, suggerendo un possibile coinvolgimento della proteina HTT nella regolazione epigenetica. Questa ipotesi sarà ulteriormente verificata mediante analisi ChIP-seq, per identificare geni bersaglio la cui espressione potrebbe essere alterata durante le prime fasi dello sviluppo neurale.