IMMUNO-AFFINITY CAPTURE AND RELEASE OF EXTRACELLULAR VESICLES AND THEIR CHARACTERIZATION AS NOVEL DIAGNOSTIC TOOLS

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane bound vesicles secreted by cells into biological fluids. Recent findings demonstrated their involvement in cell-to-cell communication under physiological and pathological conditions and their ability to influence the phenotype of recipient cells. During the last few years EVs have emerged as promising biomarkers for liquid biopsy approaches. Unfortunately, current state-of-the-art technologies regarding EVs’ separation from biological fluids and detection are far from being optimal and there is an urgent need for improvement. This Ph.D. project’s main goal is the development of reversible immuno-affinity techniques to achieve the separation of EVs from complex bodily fluids. Many kits for antibody-mediated separation of EVs are commercially available but unfortunately suffer from drawbacks limiting their use. The major limitation of the kits mentioned above is the problematic release of an EV from the antibody: the interaction between the antibody and its biological target is difficult to revert and usually requires harsh conditions such as low pH or high ionic strength buffers, often in combination with detergents. Unfortunately, these conditions lead to damage or breaking of EVs, impairing characterization methods that rely on imaging techniques (e.g., Nanoparticle Tracking Analysis, Transmission Electron Microscopy and Nanoscale Flow Cytometry), and require the presence of intact vesicles. A new perspective is provided within this thesis: immuno-affinity separation approaches usually require solid surfaces where antibodies are immobilized and are able to capture their antigen. Instead of releasing the antigen by breaking the interaction with the antibody, we propose novel strategies of reversible immobilization of antibodies. In this way, EVs can be released by detaching the antibody from the surface under mild conditions, thus preserving their intact vesicular structure and allowing their characterization by imaging techniques.

Il termine vescicole extracellulari (EVs) indica una popolazione eterogenea di vescicole circondate da membrane che vengono secrete nei fluidi biologici ad opera delle cellule. Recenti scoperte hanno dimostrato il loro ruolo nella comunicazione tra cellule in condizioni fisiologiche ma anche patologiche. Negli ultimi anni le EVs sono state analizzate come potenziali biomarcatori da utilizzare biopsia liquida. Sfortunatamente, lo stato dell’arte a riguardo della loro separazione da fluidi biologici e della loro detection è ben lontano dall’essere ottimale, delineando un urgente bisogno di sviluppo. L’obiettivo principale di questo progetto di dottorato è lo sviluppo di tecniche di cattura immuno-selettiva reversibile, al fine di separare le EVs da fluidi corporei complessi. Sul mercato sono attualmente disponibili molti kit che permettono una separazione di EVs tramite anticorpi. Tuttavia questi kit presentano numerosi svantaggi che limitano il loro impiego. Il principale è rappresentato dalla difficoltà nel rilasciare una vescicola dopo che è stata catturata da un anticorpo: l’interazione tra un anticorpo e il suo target biologico è infatti difficile da rompere, e solitamente richiede l’utilizzo di condizioni drastiche come soluzioni tampone con basso pH o alta forza ionica, spesso da usare in combinazione a detergenti. Sfortunatamente tutte queste condizioni causano il danneggiamento o la rottura delle vescicole extracellulari, impedendo la loro caratterizzazione tramite tecniche di imaging, che richiedono la presenza di vescicole intatte. Un nuovo approccio è descritto e sviluppato all’interno di questa tesi di dottorato: normalmente le tecniche di immuno-separazione richiedono la presenza di anticorpi covalentemente immobilizzati su superfici solide, dove possono catturare il loro target biologico. In questa tesi invece due diverse strategie di immobilizzazione reversibile di anticorpi sulla superficie sono proposte e sviluppate. Sfruttando queste strategie le EVs possono essere rilasciate dalla superficie staccando l’anticorpo dalla stessa in condizioni compatibile con l’integrità delle vescicole.