APPROCCIO INTEGRATO ALLO STUDIO DEL GLAUCOMA: DALLA CLINICA ALL'INDAGINE BIOCHIMICO-MOLECOLARE

Glaucoma is a neurodegenerative disease caused by ganglion cells death by apoptosis. It represents the leading cause of irreversible blindness in the world. Although the mechanisms triggering the neuronal degeneration in glaucoma have not yet been fully understood, a chronic inflammatory condition at the retinal level, sustained by abnormal IOP, is considered today a main factor in glaucoma pathogenesis. The aim of this PhD project was a multidisciplinary approach to glaucoma investigation, both clinical and bio-molecular. Firstly, a prototype of visual field analyzer (Compass, Centervue, Padua, Italy) was implemented, primarily by developing a demographic database of healthy subjects for 30-2 perimetric test. Subsequently, the test-retest reliability of the device was assessed by performing the "New Grid" visual field six straight times in a group of patients clustered according to the MD, resulting in a good inter-test reliability. The agreement between three different reviewers was also calculated: they independently examined Compass visual fields and the fundus photos, establishing whether or not the glaucomatous pathology worsened, as well as the agreement between the remote analysis and the standard clinical visit of glaucoma patients. The results highlighted an excellent agreement among the Reviewers and between remote analysis and the clinical examination. In order to establish the Compass’ point-by-point accuracy, a 10-2 visual field was performed in patients affected by geographic atrophy, finding an accurate correspondence of the perimetric scores with the underlying retinal image. Ultimately, the osmometry and all the clinical parameters of the tear film were analyzed in patients suffering from asymmetric glaucoma. Afterwards, for the biochemical and molecular approach, the analysis of gap-junction protein connexin 43 in the aqueous humor of affected and unaffected glaucoma patients was performed: a nearly double expression of the protein was found in glaucomatous subjects, even if there were no statistically significant differences, probably due to the small number of samples. An innovative method of biochemical analysis was introduced in this doctorate thesis: the metabolomics, a scientific branch that deals with the analysis of <1.5 kDa metabolites deriving from specific cellular processes in human samples. Vitreous samples of patients operated by vitrectomy were analyzed by 1H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, and an increase in acetone and methanol was observed in glaucomatous eyes.

Il glaucoma è una patologia neurodegenerativa sostenuta dalla morte per apoptosi delle CGR. Rappresenta la principale causa di cecità irreversibile al mondo. Non sono ancora stati compresi a fondo tutti i meccanismi che causano la degenerazione neuronale nel glaucoma (tanto che sussistono delle forme di glaucoma a PIO normale). Un ruolo importante nel meccanismo patogenetico glaucomatoso viene riconosciuto oggi ad una condizione di infiammazione cronica a livello retinico determinata da alterazioni dei livelli di PIO. Lo scopo del presente progetto di dottorato è stato un approccio multidisciplinare al glaucoma, di tipo clinico e biochimico-molecolare. In primo luogo, è stato implementato un prototipo di perimetro (Compass, Centervue, Padova, Italia), attuando dapprima un database normativo di soggetti sani al fine di integrare le caratteristiche demografiche per il test perimetrico 30-2. Successivamente, è stata valutata l’affidabilità test-retest dell’apparecchio, eseguendo il campo visivo “New Grid” per sei volte consecutive in un gruppo di pazienti clusterizzati secondo l’MD, ottenendo una bassa variabilità intra-test. È stato altresì calcolato l’agreement tra tre diversi revisori, i quali hanno esaminato indipendentemente le perimetrie e le foto fundus Compass, stabilendo un peggioramento o meno della patologia glaucomatosa, nonché la concordanza tra l’analisi da remoto dei campi visivi e immagini Compass, e la visita clinica standard dei pazienti affetti da glaucoma. I risultati hanno messo in evidenza un’ottima concordanza tra i Reviewers e tra gli esami da remoto e la visita clinica. Ai fini di stabilire la precisione punto per punto del perimetro, è stata eseguita un’analisi del Compass 10-2 in pazienti affetti da atrofia geografica, trovando una corrispondenza punto per punto della perimetria con l’immagine retinica sottostante. In ultimo, è stata effettuata un’analisi dell’osmolarità lacrimale e di tutti i parametri clinici del film lacrimale in pazienti affetti da glaucoma asimmetrico. Per quanto riguarda l’indagine biochimico-molecolare, è stata effettuata una analisi preliminare nell’umore acqueo della proteina di gap-junction Connessina 43 in un piccolo gruppo di soggetti sani e glaucomatosi, che ha posto in evidenza un aumento quasi doppio della dell’espressione della molecola nei soggetti glaucomatosi, anche se la ridotta numerosità del campione non ha prodotto un risultato statisticamente significativo. È stato inoltre utilizzato in questo progetto di dottorato un metodo innovativo di analisi: la metabolomica, ramo scientifico che si occupa di analizzare i metaboliti <1,5 kDa che derivano da specifici processi chimici cellulari in campioni biologici umani. Utilizzando la Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare 1H, sono stati analizzati campioni di vitreo di pazienti sottoposti a vitrectomia, identificando un aumento di acetone e metanolo negli occhi glaucomatosi.