DRUG-MEDIATED NFIX INHIBITION AS A NEW THERAPY FOR MUSCULAR DYSTROPHIES

Muscular Dystrophies (MDs) are still incurable monogenic myopathies characterized by progressive degeneration of skeletal muscle, respiratory and cardiac complications, and premature death. Dystrophic myofibers are highly fragile, due to mutations in the Dystrophin-Glycoprotein Complex (DGC), which provides a physical support to muscle contraction. In dystrophic muscles, chronic cycles of degeneration/regeneration of myofibers occur, progressively leading to an exhaustion of satellite cells, the skeletal muscle stem cells (MuSCs), and to the loss of skeletal muscle tissue. Dystrophic mice lacking the transcription factor Nfix, crucial for the switch from embryonic to fetal myogenesis, display morphological and functional improvements of the disease, due to the slowing down of muscle regeneration and to a shift towards more oxidative myofibers. Recently, we demonstrated that the MAPK (MEK/ERK) signaling pathway positively regulates the Nfix protein levels both in fetal myoblasts in vitro and in fetuses in vivo, bringing out the idea of an indirect pharmacological inhibition of Nfix in a dystrophic context. In this research project, we demonstrate that this regulation is also conserved in postnatal myoblasts. Chronic treatment of adult Sgca null mice with two FDA-approved MEK-inhibitors, Trametinib and Selumetinib, every day for 14 days by oral gavage, causes a decrease of pERK and Nfix protein levels in dystrophic skeletal muscles. The Nfix gene expression in treated muscle does not change, indicating the involvement of post-translational rather than transcriptional mechanisms of regulation. This reduction of Nfix is nevertheless not sufficient to improve the histology of dystrophic muscles, which display smaller myofibers, higher necrosis, and, unexpectedly, calcification at high drugs dosages. However, Trametinib- and Selumetinib-treated muscles exhibit more myofibers with an oxidative metabolism, which is known to protect from dystrophic damage. Our study provides a proof-of-concept that Nfix is modulated by the MEK/ERK pathway in postnatal dystrophic muscles in vivo, unraveling the regulatory network behind this crucial transcription factor in MDs. Combining the MEK-inhibitor administration with other drugs and/or a type of diet acting on calcifications might improve the treatment, setting the stage for a combined approach to face such heterogeneous diseases.

Le distrofie muscolari (DM) sono un gruppo di miopatie monogeniche ancora incurabili, caratterizzate da una progressiva degenerazione del muscolo scheletrico, da complicazioni respiratorie e cardiache, e morte prematura. Le miofibre distrofiche sono molto fragili a causa di mutazioni nel Complesso Distrofina-Glicoproteina (DGC), che fornisce un supporto fisico alla contrazione muscolare. Per via di queste mutazioni, nei muscoli distrofici si verificano cicli continui di degenerazione/rigenerazione delle miofibre, i quali causano progressivamente un esaurimento delle cellule satelliti, le cellule staminali muscolari scheletriche, e la perdita del tessuto muscolare scheletrico. I topi distrofici geneticamente privi del fattore di trascrizione Nfix, cruciale per il passaggio dalla miogenesi embrionale a quella fetale, presentano miglioramenti morfologici e funzionali della malattia. Ciò è dovuto al rallentamento della rigenerazione muscolare e ad uno cambiamento fenotipico delle miofibre verso un metabolismo più ossidative in assenza di Nfix. Recentemente, nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che la via di segnalazione delle MAPK (MEK/ERK) modula positivamente i livelli di Nfix sia nei miooblasti fetali in vitro che nei feti in vivo, suggerendo una possibile via verso un'inibizione farmacologica indiretta di Nfix in un contesto distrofico. In questo progetto di ricerca, abbiamo dimostrato che tale regolazione è conservata anche nei mioblasti postnatali. Infatti, il trattamento cronico di topi Sgca null adulti con due MEK-inibitori usati in clinica, Trametinib e Selumetinib, ogni giorno per 14 giorni tramite sonda gastrica orale, provoca una diminuzione dei livelli delle proteine pERK e Nfix nei muscoli scheletrici distrofici. L'espressione del gene Nfix nel muscolo trattato non cambia, indicando il coinvolgimento di meccanismi di regolazione post-traduzionali piuttosto che trascrizionali. Questa riduzione di Nfix non è ancora sufficiente tuttavia a garantire un miglioramento morfologico dei muscoli distrofici, i quali presentano miofibre più piccole, necrosi più alta e, inaspettatamente, delle calcificazioni in seguito a trattamento con alte dosi dei farmaci. Ciononostante, i muscoli trattati con Trametinib e Selumetinib presentano un numero più alto di miofibre con un metabolismo ossidativo, il quale protegge dai danni distrofici. Il nostro studio dimostra che Nfix è modulato dal pathway di MEK/ERK nei muscoli distrofici postnatali in vivo, facendo luce sulla rete di regolazione alla base di questo fattore di trascrizione così importante nelle MD. Combinare la somministrazione dei MEK-inibitori con altri farmaci e/o un approccio di nutrigenomica da poco sviluppato nel nostro laboratorio, che agisce sulle calcificazioni, potrebbe portare a miglioramenti nel protocollo di trattamento, ponendo le basi ad un approccio combinato per affrontare tali malattie così eterogenee.