Recently, many studies have shown that viral agents can be involved in the pathogenesis of atherosclerosis. However, their role in destabilizing atherosclerotic plaques has not yet been elucidated, and neither have their underlying molecular mechanisms. On the basis of the data currently available in the literature, we hypothesized that viral agents can promote the destabilization of already present atherosclerotic plaques, through direct infection or by mediating an immune response with systemic and especially local changes in the expression of inflammatory cytokines and chemokines, and with consequent activation of molecular pathways that would lead to the upregulation of the expression of scavenger receptors with greater affinity for oxidized LDL (CD36 and Lectine-Like-oxLDL-receptor 1 - LOX-1) on the macrophages. The aim of the study was therefore to investigate the presence of genetic material of some viral agents in the carotid plaques of patients undergoing carotid endarterectomy (CEA) at IRCCS Policlinico San Donato (Vascular Surgery Unit), the expression of local and systemic inflammatory cytokines and PPAR-γ, correlating the results obtained with the vulnerability of the removed plaque. Data from 50 patients (mean age 73.7+8.8 years) were analyzed, 31 of whom had a vulnerable plaque (62%). The comorbidities of patients with vulnerable plaque were comparable to those of patients with stable plaque. The genome of Cytomegalovirus (CMV), Herpes-Simplex (HSV), Varicella Zoster (VZV) and Influenza Virus (IV) was not found in any of the vascular sample, while the Epstein-Barr (EBV) genome was found in two vulnerable plaques, in particular in both cases it was identified in the "core" but not in their respective control area. The serological determination of anti-EBV, CMV, HSV, VZV IgM and anti-IV IgA was negative in all cases, while for IgG it revealed that all patients had been exposed to EBV, 98% to CMV, 68% to VZV and 12% to HSV. No patients were operated on in a possible active phase of influenza and nearly half of them (22/50, 44%) had been vaccinated against IV in the previous 6 months, and resulted protected by the IgG. The viral exposure of patients with vulnerable plaque was not significantly different from that of patients with stable plaque. However, 82% of patients not receiving influenza vaccination (23/28) had a vulnerable carotid plaque, compared with 36% of vaccinated patients (8/22, P=0.001). Plasma levels of inflammatory cytokines (particularly TNF-α and IL-6) were higher in patients with vulnerable plaque than in patients with non-vulnerable plaque, however independently of comorbidities, viral exposure or flu vaccination. Gene expression of the same cytokines in the plaque was greater in the "core" than in the control, especially in vulnerable plaques. Again, there were no significant differences in the expression of these cytokines based on comorbidities or viral exposure, however in patients with vulnerable plaque the expression of TNF-α in the "core" was greater in those who had not received the influenza vaccination compared to those who did. For IL-10 the opposite was observed. In addition, in vulnerable plaques, PPAR-γ tended to be more expressed in the “core” than in the control, especially in patients who had not undergone influenza vaccination. Moreover, in the group of patients with vulnerable plaque, the gene expression of PPAR-γ in the “core” of the plaques was found to be directly related to the gene expression of TNF-α, IL-1β and IL-10. Finally, the immunohistochemical examination revealed a greater presence of CD36 and LOX-1 in the “core” of the vulnerable plaques compared to stable ones. In light of our results, it is therefore not currently possible to define a possible relation between plaque vulnerability and the viral agents analyzed. However, there was a significant difference in the incidence of plaque vulnerability among patients undergoing influenza vaccination compared to those not vaccinated.

Recentemente, molti studi hanno dimostrato che gli agenti virali possono essere coinvolti nella patogenesi dell’aterosclerosi. Tuttavia, il ruolo degli stessi nella destabilizzazione delle placche aterosclerotiche non è ancora stato chiarito, e nemmeno i meccanismi molecolari sottostanti. Sulla base dei dati attualmente disponibili in letteratura, abbiamo ipotizzato che gli agenti virali possano promuovere la destabilizzazione delle placche aterosclerotiche già presenti, attraverso un’infezione diretta o mediando una risposta immunitaria con cambiamenti sistemici e soprattutto locali nell'espressione delle citochine e chemochine pro-infiammatorie, e con conseguente attivazione di pathways molecolari che porterebbero alla sovraregolazione dell'espressione dei recettori scavenger sulla superficie dei macrofagi con maggiore affinità per le LDL ossidate (CD36 e Lectine-Like-oxLDL-receptor 1 – LOX-1). Scopo dello studio è stato pertanto quello di studiare la presenza di materiale genetico di alcuni agenti virali nelle placche carotidee di pazienti sottoposti ad intervento chirurgico di endarterectomia carotidea (CEA) presso l'IRCCS Policlinico San Donato (Unità Operativa di Chirurgia Vascolare), l'espressione di citochine infiammatorie locali e sistemiche e di PPAR-γ, correlando i risultati ottenuti con la vulnerabilità della placca asportata. Sono stati analizzati i dati di 50 pazienti (età media 73,7 + 8,8 anni), 31 dei quali con placca vulnerabile (62%). Le comorbidità dei pazienti con placca vulnerabile erano paragonabili a quelle dei pazienti con placca stabile. Il genoma del Citomegalovirus (CMV), Herpes-Simplex (HSV), Varicella Zoster (VZV) e Influenza Virus (IV) non è stato trovato in nessun campione vascolare. Al contrario, il genoma di Epstein-Barr (EBV) è stato trovato in due placche vulnerabili, in particolare in entrambi i casi è stato identificato nel "core" ma non nella rispettiva area di controllo. La determinazione sierologica delle IgM anti-EBV, CMV, HSV e VZV e delle IgA anti IV è stata negativa in tutti i casi, mentre per le IgG ha rivelato che tutti i pazienti erano stati esposti a EBV, il 98% a CMV, il 68% a VZV e il 12% a HSV. Nessun paziente è stato operato in una possibile fase attiva dell'influenza e quasi la metà di loro (22/50, 44%) era stata vaccinata contro IV nei 6 mesi precedenti e risultava coperta da IgG. L'esposizione virale dei pazienti con placca vulnerabile non era significativamente diversa da quella dei pazienti con placca stabile. Tuttavia, l'82% dei pazienti non sottoposti a vaccinazione antinfluenzale (23/28) aveva una placca carotidea vulnerabile, rispetto al 36% dei pazienti vaccinati (8/22, P = 0,001). I livelli plasmatici delle citochine infiammatorie (in particolar modo TNF-α e IL-6) erano più alti nel sangue di pazienti con placca vulnerabile rispetto ai pazienti con placca non vulnerabile, tuttavia in maniera indipendente rispetto alle comorbilità, alle esposizione agli agenti virali o alla vaccinazione antinfluenzale. L’espressione genica delle stesse citochine nella placca era maggiore nel “core” rispetto al controllo, soprattutto nelle placche vulnerabili. Anche in questo caso, non vi sono state differenze significative nell’espressione di tali citochine in base alle comorbilità o all’esposizione virale, tuttavia nei pazienti con placca vulnerabile l’espressione di TNF-α nel “core” era maggiore in coloro che non erano stati sottoposti alla vaccinazione antinfluenzale rispetto ai vaccinati, mentre per IL-10 si è osservato il contrario. Nelle placche vulnerabili, inoltre, è stato osservato che PPAR-γ tende ad essere più espresso nel “core” rispetto al controllo, e soprattutto nei pazienti che non si erano sottoposti alla vaccinazione antinfluenzale. Peraltro, nel gruppo di pazienti con placca vulnerabile, l’espressione genica di PPAR-γ nel core delle placche è risultata direttamente correlata all’espressione genica di TNF-α, IL-1β e IL-10. L’esame immunoistochimico infine ha evidenziato una maggior presenza di CD36 e LOX-1 nel core delle placche vulnerabili rispetto a quelle definite come non vulnerabili. Alla luce dei nostri risultati, non è pertanto attualmente possibile attribuire il ruolo di destabilizzatori della placca agli agenti virali analizzati. Tuttavia, è stata evidenziata una significativa differenza nell’incidenza di vulnerabilità di placca tra i pazienti sottoposti a vaccinazione antinfluenzale rispetto a quelli non vaccinati.

RUOLO DELLE INFEZIONI VIRALI NELLA DESTABILIZZAZIONE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA CAROTIDEA / D.p. Mazzaccaro ; tutor: N. Basilico ; supervisore: G. Nano ; coordinatore: M. Samaja. - : . Dipartimento di Scienze Biomediche, Chirurgiche ed Odontoiatriche, 2021 Mar 17. ((33. ciclo, Anno Accademico 2020. [10.13130/mazzaccaro-daniela-palmira_phd2021-03-17].

RUOLO DELLE INFEZIONI VIRALI NELLA DESTABILIZZAZIONE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA CAROTIDEA

D.P. Mazzaccaro
2021

Abstract

Recentemente, molti studi hanno dimostrato che gli agenti virali possono essere coinvolti nella patogenesi dell’aterosclerosi. Tuttavia, il ruolo degli stessi nella destabilizzazione delle placche aterosclerotiche non è ancora stato chiarito, e nemmeno i meccanismi molecolari sottostanti. Sulla base dei dati attualmente disponibili in letteratura, abbiamo ipotizzato che gli agenti virali possano promuovere la destabilizzazione delle placche aterosclerotiche già presenti, attraverso un’infezione diretta o mediando una risposta immunitaria con cambiamenti sistemici e soprattutto locali nell'espressione delle citochine e chemochine pro-infiammatorie, e con conseguente attivazione di pathways molecolari che porterebbero alla sovraregolazione dell'espressione dei recettori scavenger sulla superficie dei macrofagi con maggiore affinità per le LDL ossidate (CD36 e Lectine-Like-oxLDL-receptor 1 – LOX-1). Scopo dello studio è stato pertanto quello di studiare la presenza di materiale genetico di alcuni agenti virali nelle placche carotidee di pazienti sottoposti ad intervento chirurgico di endarterectomia carotidea (CEA) presso l'IRCCS Policlinico San Donato (Unità Operativa di Chirurgia Vascolare), l'espressione di citochine infiammatorie locali e sistemiche e di PPAR-γ, correlando i risultati ottenuti con la vulnerabilità della placca asportata. Sono stati analizzati i dati di 50 pazienti (età media 73,7 + 8,8 anni), 31 dei quali con placca vulnerabile (62%). Le comorbidità dei pazienti con placca vulnerabile erano paragonabili a quelle dei pazienti con placca stabile. Il genoma del Citomegalovirus (CMV), Herpes-Simplex (HSV), Varicella Zoster (VZV) e Influenza Virus (IV) non è stato trovato in nessun campione vascolare. Al contrario, il genoma di Epstein-Barr (EBV) è stato trovato in due placche vulnerabili, in particolare in entrambi i casi è stato identificato nel "core" ma non nella rispettiva area di controllo. La determinazione sierologica delle IgM anti-EBV, CMV, HSV e VZV e delle IgA anti IV è stata negativa in tutti i casi, mentre per le IgG ha rivelato che tutti i pazienti erano stati esposti a EBV, il 98% a CMV, il 68% a VZV e il 12% a HSV. Nessun paziente è stato operato in una possibile fase attiva dell'influenza e quasi la metà di loro (22/50, 44%) era stata vaccinata contro IV nei 6 mesi precedenti e risultava coperta da IgG. L'esposizione virale dei pazienti con placca vulnerabile non era significativamente diversa da quella dei pazienti con placca stabile. Tuttavia, l'82% dei pazienti non sottoposti a vaccinazione antinfluenzale (23/28) aveva una placca carotidea vulnerabile, rispetto al 36% dei pazienti vaccinati (8/22, P = 0,001). I livelli plasmatici delle citochine infiammatorie (in particolar modo TNF-α e IL-6) erano più alti nel sangue di pazienti con placca vulnerabile rispetto ai pazienti con placca non vulnerabile, tuttavia in maniera indipendente rispetto alle comorbilità, alle esposizione agli agenti virali o alla vaccinazione antinfluenzale. L’espressione genica delle stesse citochine nella placca era maggiore nel “core” rispetto al controllo, soprattutto nelle placche vulnerabili. Anche in questo caso, non vi sono state differenze significative nell’espressione di tali citochine in base alle comorbilità o all’esposizione virale, tuttavia nei pazienti con placca vulnerabile l’espressione di TNF-α nel “core” era maggiore in coloro che non erano stati sottoposti alla vaccinazione antinfluenzale rispetto ai vaccinati, mentre per IL-10 si è osservato il contrario. Nelle placche vulnerabili, inoltre, è stato osservato che PPAR-γ tende ad essere più espresso nel “core” rispetto al controllo, e soprattutto nei pazienti che non si erano sottoposti alla vaccinazione antinfluenzale. Peraltro, nel gruppo di pazienti con placca vulnerabile, l’espressione genica di PPAR-γ nel core delle placche è risultata direttamente correlata all’espressione genica di TNF-α, IL-1β e IL-10. L’esame immunoistochimico infine ha evidenziato una maggior presenza di CD36 e LOX-1 nel core delle placche vulnerabili rispetto a quelle definite come non vulnerabili. Alla luce dei nostri risultati, non è pertanto attualmente possibile attribuire il ruolo di destabilizzatori della placca agli agenti virali analizzati. Tuttavia, è stata evidenziata una significativa differenza nell’incidenza di vulnerabilità di placca tra i pazienti sottoposti a vaccinazione antinfluenzale rispetto a quelli non vaccinati.
BASILICO, NICOLETTA
SAMAJA, MICHELE
Recently, many studies have shown that viral agents can be involved in the pathogenesis of atherosclerosis. However, their role in destabilizing atherosclerotic plaques has not yet been elucidated, and neither have their underlying molecular mechanisms. On the basis of the data currently available in the literature, we hypothesized that viral agents can promote the destabilization of already present atherosclerotic plaques, through direct infection or by mediating an immune response with systemic and especially local changes in the expression of inflammatory cytokines and chemokines, and with consequent activation of molecular pathways that would lead to the upregulation of the expression of scavenger receptors with greater affinity for oxidized LDL (CD36 and Lectine-Like-oxLDL-receptor 1 - LOX-1) on the macrophages. The aim of the study was therefore to investigate the presence of genetic material of some viral agents in the carotid plaques of patients undergoing carotid endarterectomy (CEA) at IRCCS Policlinico San Donato (Vascular Surgery Unit), the expression of local and systemic inflammatory cytokines and PPAR-γ, correlating the results obtained with the vulnerability of the removed plaque. Data from 50 patients (mean age 73.7+8.8 years) were analyzed, 31 of whom had a vulnerable plaque (62%). The comorbidities of patients with vulnerable plaque were comparable to those of patients with stable plaque. The genome of Cytomegalovirus (CMV), Herpes-Simplex (HSV), Varicella Zoster (VZV) and Influenza Virus (IV) was not found in any of the vascular sample, while the Epstein-Barr (EBV) genome was found in two vulnerable plaques, in particular in both cases it was identified in the "core" but not in their respective control area. The serological determination of anti-EBV, CMV, HSV, VZV IgM and anti-IV IgA was negative in all cases, while for IgG it revealed that all patients had been exposed to EBV, 98% to CMV, 68% to VZV and 12% to HSV. No patients were operated on in a possible active phase of influenza and nearly half of them (22/50, 44%) had been vaccinated against IV in the previous 6 months, and resulted protected by the IgG. The viral exposure of patients with vulnerable plaque was not significantly different from that of patients with stable plaque. However, 82% of patients not receiving influenza vaccination (23/28) had a vulnerable carotid plaque, compared with 36% of vaccinated patients (8/22, P=0.001). Plasma levels of inflammatory cytokines (particularly TNF-α and IL-6) were higher in patients with vulnerable plaque than in patients with non-vulnerable plaque, however independently of comorbidities, viral exposure or flu vaccination. Gene expression of the same cytokines in the plaque was greater in the "core" than in the control, especially in vulnerable plaques. Again, there were no significant differences in the expression of these cytokines based on comorbidities or viral exposure, however in patients with vulnerable plaque the expression of TNF-α in the "core" was greater in those who had not received the influenza vaccination compared to those who did. For IL-10 the opposite was observed. In addition, in vulnerable plaques, PPAR-γ tended to be more expressed in the “core” than in the control, especially in patients who had not undergone influenza vaccination. Moreover, in the group of patients with vulnerable plaque, the gene expression of PPAR-γ in the “core” of the plaques was found to be directly related to the gene expression of TNF-α, IL-1β and IL-10. Finally, the immunohistochemical examination revealed a greater presence of CD36 and LOX-1 in the “core” of the vulnerable plaques compared to stable ones. In light of our results, it is therefore not currently possible to define a possible relation between plaque vulnerability and the viral agents analyzed. However, there was a significant difference in the incidence of plaque vulnerability among patients undergoing influenza vaccination compared to those not vaccinated.
Viral infection; atherosclerosis; vulnerable plaque; Influenza.
Settore MED/04 - Patologia Generale
RUOLO DELLE INFEZIONI VIRALI NELLA DESTABILIZZAZIONE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA CAROTIDEA / D.p. Mazzaccaro ; tutor: N. Basilico ; supervisore: G. Nano ; coordinatore: M. Samaja. - : . Dipartimento di Scienze Biomediche, Chirurgiche ed Odontoiatriche, 2021 Mar 17. ((33. ciclo, Anno Accademico 2020. [10.13130/mazzaccaro-daniela-palmira_phd2021-03-17].
Doctoral Thesis
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