The objective of the Thesis work is a systematic study of MRSAD-phasing, a crystallographic phasing method that is becoming part of the arsenal available to crystallographers and which represents an important tool for phasing of the increasing number of large macromolecular complexes being crystallized. This method has been tested on small and medium size proteins as well as on more challenging human 20S proteasome data, taking advantage of the existing deposited models which allow for the comparison and evaluation of the results. The applicability of a general procedure for MRSAD-phasing and model building was investigated, as well as the effect of density modification, MR-search model completeness and accuracy and data multiplicity. The results from the tests on a broad variety of systems allow to draw conclusions on the potentialities and limitations of MRSADphasing, suggesting some practical guidelines for its successful application. Moreover, MRSAD-phasing has been tested on two real-life scenarios: the first is represented by the use of MRSAD to solve the structure of the first plant glutamate receptor. The second concerns the use of MRSAD for the phasing of unknown antigens through engineered nanobodies with a lanthanide binding motif recently developed within the group. The Thesis work also dealt with the structure determination of other previously unsolved protein structures, which proved resistant to many attempts at structure solution. In these cases, MRSAD could not be employed because of the unavailability of anomalous signal, and other complex phasing strategies were used. Each structure that was solved represents a difficult case with its own specificities and challenges; in keeping with the Thesis aims, a broad set of phasing strategies and phase improvement methods were used to tackle such structures.

L’obiettivo del presente lavoro di Tesi è lo studio sistematico del metodo MRSAD, un metodo di fasamento cristallografico che sta diventando sempre più un importante strumento nelle mani dei cristallografi, in particolare per quanto riguarda la risoluzione del crescente numero di strutture biologiche a elevato peso molecolare. Il metodo MRSAD è stato testato su diverse proteine a basso e medio peso molecolare e nel caso del proteasoma 20S umano, sfruttando la presenza di modelli depositati nel Protein Data Bank (PDB) che hanno reso possibile la comparazione e la valutazione dei risultati. L’applicabilità di una procedura generale per il fasamento e la costruzione di un modello nelle fasi MRSAD è stata studiata, cosí come l’effetto di procedure di “density modification”, la completezza dei modelli per Molecular Replacement, la loro accuratezza e la multiplicità dei dati cristallografici. I risultati ottenuti dall’analisi di dati relativi ad un’ampia varietà di sistemi modello permettono di ricavare conclusioni sulle potenzialità e sui limiti del fasamento attraverso MRSAD, e suggeriscono alcune linee guida per la sua applicazione al fine di massimizzare il suo successo. In aggiunta, il fasamento attraverso MRSAD è stato testato positivamente in due casi reali: il primo è rappresentato dall’uso di MRSAD per la risoluzione della struttura del primo recettore del glutammato di pianta. Il secondo riguarda invece l’impiego di MRSAD per il fasamento di antigeni attraverso l’impiego di nano-anticorpi (“nanobodies”) ingegnerizzati con una sequenza in grado di legare ioni di lantanidi, sviluppati recentemente all’interno del gruppo. Il lavoro di Tesi ha anche riguardato la determinazione di alcune strutture rimaste a lungo irrisolte. In questi casi, non è stato possibile ricorrere all’uso di MRSAD a causa della mancanza di dati con segnale anomalo, ed altre strategie di fasamento sono state impiegate. Ognuna delle strutture che è stata risolta rappresenta un caso difficile con le sue proprie peculiarità, ed un ampio spettro di strategie di fasamento e metodi di miglioramento delle fasi è stato impiegato per la loro risoluzione.

MRSAD-PHASING OF LARGE MACROMOLECULAR COMPLEXES / R. Pederzoli ; scientific tutors: T. R. Schneider, M. Bolognesi. - Milano : Università degli studi di Milano. Università degli Studi di Milano, 2020 Jan 31. ((32. ciclo, Anno Accademico 2019.

MRSAD-PHASING OF LARGE MACROMOLECULAR COMPLEXES

R. Pederzoli
2020-01-31

Abstract

L’obiettivo del presente lavoro di Tesi è lo studio sistematico del metodo MRSAD, un metodo di fasamento cristallografico che sta diventando sempre più un importante strumento nelle mani dei cristallografi, in particolare per quanto riguarda la risoluzione del crescente numero di strutture biologiche a elevato peso molecolare. Il metodo MRSAD è stato testato su diverse proteine a basso e medio peso molecolare e nel caso del proteasoma 20S umano, sfruttando la presenza di modelli depositati nel Protein Data Bank (PDB) che hanno reso possibile la comparazione e la valutazione dei risultati. L’applicabilità di una procedura generale per il fasamento e la costruzione di un modello nelle fasi MRSAD è stata studiata, cosí come l’effetto di procedure di “density modification”, la completezza dei modelli per Molecular Replacement, la loro accuratezza e la multiplicità dei dati cristallografici. I risultati ottenuti dall’analisi di dati relativi ad un’ampia varietà di sistemi modello permettono di ricavare conclusioni sulle potenzialità e sui limiti del fasamento attraverso MRSAD, e suggeriscono alcune linee guida per la sua applicazione al fine di massimizzare il suo successo. In aggiunta, il fasamento attraverso MRSAD è stato testato positivamente in due casi reali: il primo è rappresentato dall’uso di MRSAD per la risoluzione della struttura del primo recettore del glutammato di pianta. Il secondo riguarda invece l’impiego di MRSAD per il fasamento di antigeni attraverso l’impiego di nano-anticorpi (“nanobodies”) ingegnerizzati con una sequenza in grado di legare ioni di lantanidi, sviluppati recentemente all’interno del gruppo. Il lavoro di Tesi ha anche riguardato la determinazione di alcune strutture rimaste a lungo irrisolte. In questi casi, non è stato possibile ricorrere all’uso di MRSAD a causa della mancanza di dati con segnale anomalo, ed altre strategie di fasamento sono state impiegate. Ognuna delle strutture che è stata risolta rappresenta un caso difficile con le sue proprie peculiarità, ed un ampio spettro di strategie di fasamento e metodi di miglioramento delle fasi è stato impiegato per la loro risoluzione.
BOLOGNESI, MARTINO
The objective of the Thesis work is a systematic study of MRSAD-phasing, a crystallographic phasing method that is becoming part of the arsenal available to crystallographers and which represents an important tool for phasing of the increasing number of large macromolecular complexes being crystallized. This method has been tested on small and medium size proteins as well as on more challenging human 20S proteasome data, taking advantage of the existing deposited models which allow for the comparison and evaluation of the results. The applicability of a general procedure for MRSAD-phasing and model building was investigated, as well as the effect of density modification, MR-search model completeness and accuracy and data multiplicity. The results from the tests on a broad variety of systems allow to draw conclusions on the potentialities and limitations of MRSADphasing, suggesting some practical guidelines for its successful application. Moreover, MRSAD-phasing has been tested on two real-life scenarios: the first is represented by the use of MRSAD to solve the structure of the first plant glutamate receptor. The second concerns the use of MRSAD for the phasing of unknown antigens through engineered nanobodies with a lanthanide binding motif recently developed within the group. The Thesis work also dealt with the structure determination of other previously unsolved protein structures, which proved resistant to many attempts at structure solution. In these cases, MRSAD could not be employed because of the unavailability of anomalous signal, and other complex phasing strategies were used. Each structure that was solved represents a difficult case with its own specificities and challenges; in keeping with the Thesis aims, a broad set of phasing strategies and phase improvement methods were used to tackle such structures.
Settore BIO/10 - Biochimica
MRSAD-PHASING OF LARGE MACROMOLECULAR COMPLEXES / R. Pederzoli ; scientific tutors: T. R. Schneider, M. Bolognesi. - Milano : Università degli studi di Milano. Università degli Studi di Milano, 2020 Jan 31. ((32. ciclo, Anno Accademico 2019.
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