MICROENVIRONMENT FACTORS PROMOTING THE QUALITY OF IMMATURE VITRIFIED OOCYTES IN THE DOMESTIC CAT MODEL

Domestic cat immature vitrified oocytes (VOs) are a useful research model to develop gamete cryopreservation protocols for fertility and biodiversity preservation in wild, endangered felids. Although vitrification of immature oocytes is convenient for its practical advantages (availability of gametes, speed and field-feasibility of the technique), VOs often degenerate after warming, and their in vitro maturation and embryo development rates are poor compared to fresh oocytes. Therefore, improvements are necessary to fully exploit their potential. Physico-chemical enrichments to the vitrification protocol or to the post-warming culture conditions could be useful to improve VOs developmental competence. In this project, minimum volume vitrification of immature oocytes with the Cryotop method resulted in high (90.8%), consistent and reproducible post-warming viability rates. To improve VOs maturation and development outcomes, two strategies were then employed. The creation of 3D follicle-like structures (i.e. granulosa cells cultured in alginate microcapsules) to be used as enriched culture condition for the in vitro maturation of VOs resulted in maintenance of steroidogenic activity of granulosa cells and in meiosis resumption of co-cultured VOs (11.8% maturation). Instead, after the assessment of apoptotic activation in VOs, the addition of a chemical pan-caspase inhibitor resulted in maturation rates (53.1%) similar to those of fresh control oocytes and in good embryonic developmental rates (34.4%). Embryo development to late embryo stages remained scarce, and further investigation to enhance VOs developmental competence are needed. Molecular investigation on the mechanisms of cryopreservation-induced damages and on the peculiarities of the embryos derived from cryopreserved oocytes could improve VOs in vitro outcomes and therefore foster the creation of feline gamete biobanks.

Gli oociti immaturi vitrificati (VOs) di gatto domestico sono un modello utile per sviluppare protocolli di crioconservazione dei gameti per la salvaguardia della fertilità e della biodiversità nei felini selvatici a rischio estinzione. Sebbene la vitrificazione di oociti immaturi sia conveniente per i suoi vantaggi pratici (disponibilità di gameti, velocità e possibilità di esecuzione in campo della tecnica), i VOs spesso degenerano dopo il warming (i.e. il ripristino della temperatura fisiologica dopo vitrificazione), e i loro tassi di maturazione e sviluppo embrionale in vitro sono scarsi se comparati a quelli degli oociti freschi. Pertanto, sono necessari miglioramenti per sfruttare appieno il loro potenziale, come degli arricchimenti fisico-chimici al protocollo di vitrificazione o alle condizioni di coltura post-warming. In questo progetto, la vitrificazione di oociti immaturi con il metodo Cryotop ha prodotto tassi di vitalità elevati (90,8%), ripetibili e riproducibili. Per migliorare la maturazione dei VOs e il loro sviluppo, sono state poi impiegate due strategie. La prima ha previsto la creazione di strutture tridimensionali simil-follicolari (i.e. cellule della granulosa coltivate in microcapsule di alginato), utilizzate come condizione di coltura arricchita per la maturazione in vitro dei VOs, e ha portato al mantenimento dell'attività steroidogenica delle cellule della granulosa e alla ripresa della meiosi dei VOs co-coltivati (11,8% di maturazione). La seconda strategia invece, dopo la valutazione dell'attivazione apoptotica nei VOs, ha previsto l'aggiunta di un inibitore chimico delle caspasi che ha prodotto tassi di maturazione (53,1%) simili a quelli degli oociti freschi di controllo e buoni tassi di sviluppo embrionale (34,4%). Lo sviluppo embrionale a stadi avanzati è rimasto scarso, e sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzare la competenza di sviluppo dei VOs. Indagini molecolari sui danni indotti dalla crioconservazione e sulle peculiarità degli embrioni derivati da oociti crioconservati potrebbero migliorare i risultati dei VOs in vitro, e quindi favorire la creazione di biobanche per i gameti felini.