FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL GENETIC VARIANT PREDISPOSING TO ADVANCED FIBROSIS AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA DEVELOPMENT IN NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

Functional characterization of a novel genetic variant predisposing to advanced fibrosis and hepatocellular carcinoma development in nonalcoholic fatty liver disease Introduction Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) represents the most common chronic liver disease in the Western countries and represent an emerging cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Several studies underlined the importance of heritability in modifying the susceptibility and progression of NAFLD. However, the specific determinants of NAFLD heritability remain largely unkonwn. Aims In the hypothesis that rare genetic variants with a strong impact on protein activity account for a fraction of NAFLD missing heritability, the first aim of the current study was to identify by Whole Exome Sequencing (WES) novel rare genetic variants determining an alteration of protein activity associated with advanced stage NAFLD. As we detected an association with a variant in Interferon regulatory protein 3 (IRF3) and hepatocellular carcinoma (HCC) related to NAFLD, we next examined the specific regulation of IRF3 isoforms in patients at risk of NAFLD in relation to liver damage, and tried to understand IRF3 regulation and to model the impact of IRF3 alternative transcripts downregulation by exploiting CRISPR/Cas9 gene editing approach in in vitro models. Finally, we tested the impact of IRF3 pathway inhibition by amlexanox, a TBK1-IRF3 axis inhibitor under study for the treatment of obesity related complications, on the proliferation of hepatoma cells (HepG2).   Patients and methods • Variants discovery was performed by WES in 72 Italian NAFLD-HCC patients and 50 healthy individuals. HCC patients were compared to those in the European population (Exome Aggregation Consortium Non-Finnish Europeans, N=33,370). • Validation was performed in NAFLD HCC patients (N=105) and in 211 patients with Advanced fibrosis (N=211), further 270 Italian healthy individuals. Furthermore, a larger database was used to evaluate the European population (genome aggregation consortium, N=64,603). • Transcriptomic analyses were performed on 125 severely obese individuals (Transcriptomic cohort) who underwent to percutaneous liver biopsy performed during bariatric surgery. Bulk RNA-Seq was performed on RNA extracted from flash-frozen liver biopsies. • To evaluate the effect of IRF3-CL a somatic variant in the IRF3-CL specific exon 7 splicing acceptor was introduced. Briefly, a Doxycycline (Therm-Fisher, Waltham, US) inducible Cas9 expressing HepG2 cell line was produced by lentiviral infection exploiting was produced exploiting Edit-R Inducible Lentiviral Cas9 Nuclease vectors (Dharmacon, Lafayette, U.S.A.). Specific guide RNA was designed using CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/) and cloned into an sgRNA expression vector (Addgene #51133) and doxycycline treated cells were transfected with the expression vector. Single cell derived populations were obtained by limiting diluition method and presence of mutations in the specified locus was investigated by T7 nuclease assay (New England Biolabs, Ipswich, US) and further confirmed by Sanger sequencing.   Results The rs141490768 SNP in IRF3 resulted enriched in HCCs compared with European population (OR=37.1, p=4.5*10-7). We validated this association in the replication cohort (N=211, p=0.049; OR=5.8; 95% CI = 0.7-21). In the overall series of patients with advanced NAFLD (N=388), the association remained significant (OR=11; 95% CI= 4-24; p=6.16*10-6). The rs141490768 encodes a loss-of-function variant (A418T) in the IRF3 inhibitory isoform IRF3-CL, suggesting that increased IRF3 activity may predispose to NAFLD-HCC. Furthermore, two non-coding transcripts of unknown function (referred as IRF3-NC1 and IRF3-NC2, respectively) also overlap with the rs141490768 locus. Burden test analysis revealed enrichment in rare variants altering specifically IRF3-CL in both our HCC discovery (p=5.69*10-7; OR= 35.5; 95% CI = 11-90) and the patients of our advanced fibrosis cohort with available WES data (OR=6.4; 95% CI= 0.8-24; p=0.04). Transcriptomic analyses revealed high expression levels of IRF3, IRF3-CL, and IRF3-NC1. Moreover, the IRF3-CL mRNA levels were directly correlated with the disease stage, whereas those of IRF3-NC1 were inversely correlated (β=1.3 and -0,77, respectively; p<0.05, both). Immunohistochemical analysis revealed overexpression and hyperactivation of IRF3 according to NAFLD transition to fibrogenic steatohepatitis and HCC. Furthermore, IRF3 was overexpressed in tumor tissue compared with healthy tissue in a cohort of 20 patients of the TCGA database, and in histological samples. In HepG2 hepatoma cells, exposure to free fatty acids triggered IRF3 activation, supporting its involvement in NAFLD pathogenesis. Furthermore, IRF3 was also responsive to proliferation stimuli. To model the impact of IRF3-CL loss of function effect on hepatocyte biology, we developed IRF3-CL+/- HepG2 by CRISPR-Cas9 genome editing. As expected, IRF3-CL+/- HepG2 more sustained IRF3 activation in response to serum. Exposure of HepG2 to amlexanox, alone in combination with sorafenib, was able to impair cell growth rate, but more so in IRF3-CL+/- cells.   Conclusion In conclusion, the rs141490768 IRF3 variant was associated with an increased risk to develop advanced NAFLD. Moreover, IRF3 upregulation was associated liver disease severity, in parallel with induction of the inflammatory response, altered lipid metabolism and cell proliferation. Even if further mechanistic studies are required to clarify the complex network of interactions among alternative IRF3 transcripts, our in vitro experiments confirm that IRF3-CL exerts an inhibitory effect on the activation of the main IRF3 isoform, which promotes cell proliferation. Altogether, data suggest that the mechanism underpinning the association of the rs141490768 variant with NAFLD progression to severe fibrosis and HCC is related to facilitation of IRF3 pathway activation. Finally, results support the necessity of further studies to examine the possible role of amlexanox (or other Ikk-epsilon inhibitors) in NAFLD treatment and points out this class of chemicals as good candidates to be further evaluated for the treatment of NAFLD HCC in combination with Sorafenib.

Functional characterization of a novel genetic variant predisposing to advanced fibrosis and hepatocellular carcinoma development in nonalcoholic fatty liver disease Introduzione La steatosi epatica non alcoolica (NAFLD) rappresenta la più comune tra le malattie epatiche croniche nei paesi occidentali e rappresenta una causa emergente di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare (HCC). Numerosi studi hanno sottolineato l'importanza di vari tratti ereditari nel modificare la suscettibilità e il decorso di questa malattia. Tuttavia, la componente ereditabile di NAFLD resta in larga misura sconosciuta. Scopo dello studio Nell’ipotesi che una componente dell’ereditarietà della NFLD sia rappresentata da varianti genetiche rare con un forte impatto sull’attività proteica, il primo obiettivo di questo studio è stato quello di identificare, mediante Whole Exome Sequencing (WES), nuove varianti genetiche rare che determinassero un'alterazione dell'attività proteica e si associassero agli stadi avanzati della NAFLD. Abbiamo rilevato un'associazione tra una variante nel gene interferon regulatory factor 3 (IRF3) e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare (HCC) correlato alla NAFLD. Abbiamo successivamente esaminato la regolazione specifica delle isoforme di IRF3 nei pazienti a rischio di NAFLD in relazione al danno epatico, abbiamo cercato di comprendere il ruolo di IRF3 nella biologia dell’epatocita e, infine, di mimare l'impatto della perdita di funzione dei trascritti alternativi di IRF3 sfruttando l'approccio di CRISPR/Cas9 genome editing in modelli in vitro. Infine, abbiamo testato l'impatto dell'inibizione della via di IRF3 sul tasso di proliferazione di cellule epatiche (HepG2) da parte dell'amlexanox. Quest’ultimo è un inibitore dell'asse TBK1-IRF3 in studio per il trattamento delle complicanze legate all'obesità.   Metodi e Pazienti • Abbiamo effettuato il sequenziamento dell'intero esoma (WES) di 72 pazienti NAFLD-HCC italiani e 50 individui sani. I pazienti HCC sono stati confrontati con la popolazione europea (Europei non finlandesi inclusi nell’ Exome Aggregation Consortium, N = 33,370). • Le associazioni sono state validate in un altro gruppo di pazienti con HCC correlato a NAFLD (N = 105), in 211 pazienti con fibrosi avanzata (N = 211) e altri 270 individui Italiani sani. Inoltre, è stato utilizzato un database più ampio per valutare la popolazione europea (genome aggreagation consortium, N = 64.603). • Sono state eseguite analisi trascrittomiche su 125 soggetti gravemente obesi (coorte trascrittomica) sottoposti a biopsia epatica percutanea eseguita durante un intervento chirurgico bariatrico. L'RNA-Seq è stato eseguito su RNA estratto da biopsie epatiche congelate rapidamente. • Per valutare l'effetto di IRF3-CL è stata introdotta una variante somatica nell'accettore di splicing dell’esone 7 specifico di IRF3-CL. In breve, abbiamo generato una linea di cellule HepG2 esprimente Cas9 sotto il controllo di un promotore inducibile da dxiciclina usando vettori lentivirali (Dharmacon, Lafayette, U.S.A.). L’RNA guida specifico è stato disegnato utilizzando il CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/) e clonato in un vettore di espressione (Addgene # 51133). Infine, le cellule trattate con doxiciclina sono state trasfettate con il vettore di espressione. Popolazioni clonali derivate da singole cellule sono state ottenute con il metodo della diluizione limite. In seguito, la presenza di mutazioni nel locus specificato è stata studiata mediante test nucleasi T7 (New England Biolabs, Ipswich, USA) e ulteriormente confermata con sequenziamento diretto (metodo di Sanger).   Risultati La variante IRF3 rs141490768 è risultata più frequente nel gruppo di pazienti con HCC rispetto alla popolazione europea (OR = 37,1, p = 4,5 * 10-7) e, allo stesso modo, era più frequente nei pazienti con fibrosi avanzata (N = 211, p = 0,049; OR = 5,8; IC al 95% = 0,7-21). Considerando tutti i pazienti con epatopatia avanzata (N = 388), l'associazione è rimasta fortemente significativa (OR = 11; IC 95% = 4-24; p = 6,16 * 10-6). rs141490768 codifica una variante loss-of-function (A418T) nell'isoforma regolatoria IRF3-CL, suggerendo che una maggiore attività dell'IRF3 può predisporre al NAFLD-HCC. Inoltre, anche due trascritti non codificanti a funzione sconosciuta (rispettivamente IRF3-NC1 e IRF3-NC2) si sovrappongono al locus rs141490768. Mediante Burden test abbiamo riscontrato che vi era un arricchimento in varianti rare che alterano specificamente IRF3-CL sia nei pazienti con HCC (p = 5,69 * 10-7; OR = 35,5; IC al 95% = 11-90) che in quelli con fibrosi avanzata (OR = 6,4; IC al 95% = 0,8-24; p = 0,04). Le analisi di trascrittomica hanno rivelato livelli elevati di espressione di IRF3, IRF3-CL e IRF3-NC1. Inoltre, i livelli di mRNA di IRF3-CL erano direttamente correlati con lo stadio della malattia, mentre quelli di IRF3-NC1 erano inversamente correlati (β = 1,3 e -0,77, rispettivamente; p <0,05, entrambi). Mediante analisi immunoistochimica abbiamo evidenziato un’overespressione e iperattivazione di IRF3 in base alla severità del danno epatico. Inoltre, IRF3 è risultato overespresso nel tessuto tumorale rispetto al tessuto sano in una coorte di 20 pazienti del database TCGA e in campioni istologici. Sfruttando modelli in vitro abbiamo visto come l'esposizione ad acidi grassi liberi riesca attivare IRF3 in cellule HepG2, supportando il suo coinvolgimento nella patogenesi NAFLD. Allo stesso modo, anche stimoli proliferativi erano in grado di attivare questo fattore trascrizionale. Per mimare l'impatto della perdita di funzione di IRF3-CL e valutarne l’effetto sulla biologia degli epatociti, abbiamo sviluppato una linea di HepG2 parzialmente difettiva per IRF3-CL. Come previsto, le cellule IRF3-CL +/- presentavano un’attivazione di IRF3 più sostenuta in risposta al siero. Inoltre l'esposizione delle HepG2 all'amlexanox, da solo in combinazione con sorafenib, risultava in grado di ridurre il tasso di crescita cellulare. Questo effetto risultava più evidente nelle cellule IRF3-CL+/-.   Conclusioni In conclusione, la variante IRF3 rs141490768 è associata ad un aumentato rischio di sviluppare stadi avanzati di NAFLD. Inoltre, l'overespressione di IRF3 è stata associata alla gravità della malattia epatica, in parallelo con l'induzione della risposta infiammatoria, l’alterazione del metabolismo lipidico e la proliferazione cellulare. Anche se saranno necessari ulteriori studi meccanicistici per chiarire la complessa rete di interazioni tra le varie isoforme di IRF3, i nostri esperimenti in vitro confermano che IRF3-CL esercita un effetto inibitorio sull'attivazione dell'isoforma principale, che induce la proliferazione cellulare. Complessivamente, i dati suggeriscono che il meccanismo alla base dell'associazione della variante rs141490768 con la progressione NAFLD a fibrosi grave e HCC è correlato a un’attivazione aberrante della via di IRF3. Infine, i risultati supportano la necessità di ulteriori studi per esaminare il possibile ruolo dell'amlexanox (o altri inibitori Ikk-epsilon) nel trattamento della NAFLD e indicano questa classe di farmaci come buoni candidati da valutare ulteriormente per il trattamento di NAFLD HCC in combinazione con sorafenib.