BASIC PENTACYSTEINE PROTEINS: UNDERSTANDING THEIR ROLES AND MOLECULAR MECHANISMS DURING REPRODUCTIVE DEVELOPMENT IN ARABIDOPSIS THALIANA

The GAGA binding proteins BASIC PENTACYSTEINE PROTEINS (BPCs) are transcription factors, present in several plant species. The Arabidopsis BPCs family is composed of seven members that have been divided in three different classes, based on their protein sequence similarity (Meister et al., 2004). BPCs are ubiquitously expressed in the plant and analysis of the mutants reveal a redundant function in different stages of plant development (Monfared et al., 2011). BPCs directly bind SEEDSTICK (STK) promoter on C-boxes, whose mutations affects its expression in the flower (Simonini et al., 2012). Another important regulator of STK is the MADS-domain factor SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP); it represses STK expression during the first stages of flower development, by direct binding to its promoter on specific MADS-domain binding sites, named CArG-boxes (Simonini et al., 2012; Gregis et al., 2013). Here we show that MADS-domain binding sites on the STK promoter region are important for the correct spatial and temporal expression of the homeotic gene. We also proved that BPCs of class II and SVP can form hetero-dimers. Our data clarify the role of BPCs in regulating STK expression, mostly shedding light in the molecular mechanisms by which BPCs and SVP act. We found that BPCs of class I and II act redundantly and together with SVP to repress STK expression in the flower; these factors can interact with a member of POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX1 (PRC1), LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 (LHP1). We propose that the complex acts maintaining and spreading the H3K27me3 repressive mark to the regulatory region of STK in reproductive tissues. We further characterize the role of LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 (LHP1) in STK expression. Our results investigate the involvement of a protein complex in which BPCs, MADS-domain factors and LHP1 cooperate to regulate the expression of homeotic genes during development and pave the way for a more comprehensive understanding of gene regulation in plants.

Il mio lavoro di dottorato si basa prevalentemente sullo studio di una classe di fattori trascrizionali, le BASIC PENTACYSTEINE PROTEINS (BPCs) in Arabidopsis thaliana. I BPCs possono legare il DNA al livello di specifiche sequenze consenso, le C-boxes, per regolare l’espressione di geni target. Il primo obiettivo della mia tesi è quello di identificare il meccanismo molecolare di azione dei BPCs nella regolazione del gene d’identità dell’ovulo SEEDSTICK (STK) durante lo sviluppo del fiore. A tale scopo, sono stati condotti esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in diversi background, in cui è stata valutato il legame dei BPCs alla sequenza regolatrice di STK. Inoltre, l’analisi dell’espressione del gene omeotico nel quintuplo mutante bpc (bpcV) ha confermato una sua regolazione da parte dei BPCs e svelato il ruolo ridondante dei BPCs di classe I e classe II. I nostri risultati indicano che i BPCs possano regolare STK, interagendo con il fattore MADS-domain SVP, la cui attività è necessaria per la corretta espressione del gene omeotico. Inoltre, il mio lavoro ha permesso di identificare un altro regolatore di STK, LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1), un componente del POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 1 (PRC1). I dati, presentati in questa tesi, suggeriscono che i BPCs possano formare un super complesso proteico per regolare STK durante lo sviluppo del fiore. I BPCs sono espressi in tutti i tessuti della pianta durante lo sviluppo. Il gineceo del quintuplo mutante bpc è caratterizzato da difetti nello sviluppo del septum e del transmitting tract, una struttura che riveste un ruolo fondamentale durante la fecondazione. Il ruolo dei BPCs nello sviluppo del gineceo è stato studiato attraverso diversi esperimenti, con lo scopo di identificare i loro target e partners per localizzarli nel network di regolazione dello sviluppo del septum. Inoltre, l’analisi trascrittomica sul bpcV ha permesso di identificare un possibile contributo dei BPCs nella regolazione dei livelli di auxina e citochinine, due fitormoni, la cui attività è fondamentale per il corretto sviluppo del gineceo. In conclusione, il lavoro presentato nella mia tesi approfondisce i meccanismi molecolari che governano lo sviluppo riproduttivo nelle piante.