Fusarium head blight (FHB), root rot (FRR) and foot rot (FFR) cause important yield losses in wheat. The harvested product is often contaminated with mycotoxins, belonging to the group of trichothecenes. The main causal agents are Fusarium graminearum, F. culmorum and F. pseudograminearum. The biocontrol approach is a feasible option in order to reduce disease severity, as well as trichothecene contamination in grains. Streptomyces spp. are Gram-positive bacteria, ubiquitous in soil and endophytes of inner tissues of plant roots. They produce a wide range of secondary metabolites able to limit pathogen development and disease severity in planta, as well as to enhance plant growth. This PhD project aimed to select Streptomyces strains active within the wheat-Fusarium spp. pathosystem. To achieve this, a detailed literature and patents analysis focused on biocontrol of toxigenic Fusarium spp. was carried out (Chapter 1) and new methodological approaches for antagonist screening have been developed (Chapter 2). Furthermore, the biocontrol efficacy of a selected subset of strains obtained from the culture collection maintained at the Plant Pathology laboratory (DeFENS, University of Milan, Italy) was evaluated in different conditions (Chapter 3) and bioactive metabolites were isolated (Chapter 4). The influence of growth media and Fusarium strain diversity on streptomycete antifungal activity was assessed in dual culture assays. All the factors influenced the level of antifungal activity. The media commonly used for in vitro screening reduced the inhibitory activity of streptomycetes. Overall, results from dual culture assays and level of disease protection observed in planta did not correlate, except for those recorded on a medium based on wheat grains. Indeed, it was the most effective in eliciting antifungal activity and showed the highest correlation (r = 0.5) with FRR inhibition. Subsequently, being TRI5 the first and essential gene involved in trichothecene biosynthetic pathway in Fusarium spp., a microplate bioassay using a TRI5::GFP transformed F. graminearum strain was developed and validated in order to screen the effect of natural products on GFP fluorescence and consequently on trichothecene production. Surprisingly, culture filtrate from DEF39 strain completely suppressed deoxynivalenol (DON) production without affecting fungal growth. The most promising isolates (N = 21) were further characterized for their potential plant growth promotion ability, as well as for their activity against FRR and FFR in wheat seedlings. None of them was able to increase plant growth. However, DEF09 strain exhibited consistent efficacy to limit FRR-FFR symptom severity (protection level > 40%) in soil and soilless conditions. Therefore, a field trial was performed to test its ability to reduce FHB severity, obtaining up to 60% protection. Based on the activity observed from the previous screenings, four promising streptomycetes (DEF09, DEF20, DEF39, DEF48) were applied on sterilized wheat grains (microsilage) at two timepoints of application, in order to evaluate their ability to suppress fungal growth and DON production. Moreover, the fitness of streptomycetes in microsilage conditions was assessed by qPCR analysis. Streptomycetes were able to efficiently colonize the substrate, which resulted in reducing fungal biomass and DON accumulation only when co-inoculated with the pathogen. A pool of promising biocontrol agents has been selected against fungal development and/or DON production. This research highlighted the complexity of finding an efficient screening procedure due to multiple interactions occurring in wheat-Fusarium spp. pathosystem. Further studies will be needed to confirm the activity of the strains in planta. The identification of the mechanisms of action and the molecules involved in the bioactivity of the strains will possibly allow to develop effective treatments limiting trichothecene accumulation in wheat.

La fusariosi della spiga e il marciume al colletto in frumento sono malattie causate da Fusarium graminearum, F. culmorum e F. pseudograminearum. Essi determinano ingenti perdite di raccolto oltre a contaminare il prodotto con micotossine appartenenti alla famiglia dei tricoteceni. I batteri Gram-positivi appartenenti al genere Streptomyces sono ubiquitari nel suolo ed endofiti dei tessuti interni delle radici. Essi producono una vasta gamma di metaboliti secondari con proprietà antimicrobiche e possono essere utilizzati come agenti promotori della crescita delle piante, limitando lo sviluppo dei patogeni. L’obiettivo del presente dottorato di ricerca è stato quello di selezionare ceppi di streptomiceti attivi contro Fusarium spp. in grano. La prima fase dello studio ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’utilizzo di streptomiceti contro specie micotossigene appartenenti al genere Fusarium (Chapter 1). Successivamente sono state sviluppate strategie innovative per la selezione degli stessi (Chapter 2) e l’efficacia dei ceppi più promettenti è stata poi saggiata in diverse condizioni (Chapter 3). Inoltre, i metaboliti secondari responsabili dell’attività antifungina sono stati caratterizzati (Chapter 4). L’influenza della variabilità dei ceppi di Fusarium spp. e dei substrati colturali sull’attività di biocontrollo è stata valutata tramite saggi di antibiosi. Questi fattori hanno avuto un’influenza significativa nel determinare il livello di attività in vitro. I mezzi standard utilizzati in laboratorio hanno diminuito infatti tale parametro. Inoltre è stata riscontrata un’assenza di correlazione con il livello di biocontrollo ottenuto in pianta. Unica eccezione è per i risultati ottenuti utilizzando un terreno a base di frumento, che ha permesso di osservare un valore di correlazione più elevato con il livello di biocontrollo riscontrato contro marciume radicale in frumento (r = 0.5). Successivamente, al fine di saggiare metaboliti limitanti la produzione di tricoteceni, è stato sviluppato un sistema in micropiastra che misura la fluorescenza emessa da un ceppo di F. graminearum trasformato con il costrutto TRI5::GFP. TRI5 è il primo gene essenziale coinvolto nella via metabolica di produzione di tricoteceni. Da questa prova si è potuto selezionare il ceppo di streptomicete DEF39 che riduce significativamente la produzione di DON. Le potenziali attività di promozione della crescita e di biocontrollo di una selezione dei ceppi più promettenti (N = 21) sono state saggiate in pianta. Gli streptomiceti testati non hanno esibito la capacità di aumentare i parametri di sviluppo dei germinelli di frumento, ma il ceppo DEF09 ha ridotto significativamente il marciume al colletto e la fusariosi della spiga ottenendo livelli di protezioni sopra al 40% e del 60% rispettivamente. Basandosi sui risultati ottenuti, quattro ceppi (DEF09, DEF20, DEF39, DEF48) sono stati applicati su grano sterilizzato testando due tempistiche di trattamento per osservarne la capacità di riduzione della biomassa fungina e della produzione di DON. Inoltre tramite qPCR si è osservata la fitness degli agenti di biocontrollo nelle condizioni testate. Gli streptomiceti, abili colonizzatori del substrato testato, sono stati efficaci nel ridurre la produzione di micotossine, limitando -quando co-inoculati con il patogeno- lo sviluppo dello stesso. I ceppi selezionati agiscono perciò sia contro lo sviluppo fugino e/o contro la produzione di DON. Ulteriori studi saranno necessari per confermarne l’attività in pianta, così come per permettere lo sviluppo di formulati efficaci per limitare la contaminazione da tricoteceni.

EXPLORING STREPTOMYCES-FUSARIUM INTERACTION TO HAMPER WHEAT HEAD BLIGHT, CROWN ROT AND DEOXYNIVALENOL PRODUCTION / E.m. Colombo ; supervisor: M. Pasquali ; coordinatore: A. Pagliarini. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE PER GLI ALIMENTI, LA NUTRIZIONE E L'AMBIENTE, 2019 Dec 06. ((32. ciclo, Anno Accademico 2019. [10.13130/colombo-elena-maria_phd2019-12-06].

EXPLORING STREPTOMYCES-FUSARIUM INTERACTION TO HAMPER WHEAT HEAD BLIGHT, CROWN ROT AND DEOXYNIVALENOL PRODUCTION

E.M. Colombo
2019

Abstract

La fusariosi della spiga e il marciume al colletto in frumento sono malattie causate da Fusarium graminearum, F. culmorum e F. pseudograminearum. Essi determinano ingenti perdite di raccolto oltre a contaminare il prodotto con micotossine appartenenti alla famiglia dei tricoteceni. I batteri Gram-positivi appartenenti al genere Streptomyces sono ubiquitari nel suolo ed endofiti dei tessuti interni delle radici. Essi producono una vasta gamma di metaboliti secondari con proprietà antimicrobiche e possono essere utilizzati come agenti promotori della crescita delle piante, limitando lo sviluppo dei patogeni. L’obiettivo del presente dottorato di ricerca è stato quello di selezionare ceppi di streptomiceti attivi contro Fusarium spp. in grano. La prima fase dello studio ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’utilizzo di streptomiceti contro specie micotossigene appartenenti al genere Fusarium (Chapter 1). Successivamente sono state sviluppate strategie innovative per la selezione degli stessi (Chapter 2) e l’efficacia dei ceppi più promettenti è stata poi saggiata in diverse condizioni (Chapter 3). Inoltre, i metaboliti secondari responsabili dell’attività antifungina sono stati caratterizzati (Chapter 4). L’influenza della variabilità dei ceppi di Fusarium spp. e dei substrati colturali sull’attività di biocontrollo è stata valutata tramite saggi di antibiosi. Questi fattori hanno avuto un’influenza significativa nel determinare il livello di attività in vitro. I mezzi standard utilizzati in laboratorio hanno diminuito infatti tale parametro. Inoltre è stata riscontrata un’assenza di correlazione con il livello di biocontrollo ottenuto in pianta. Unica eccezione è per i risultati ottenuti utilizzando un terreno a base di frumento, che ha permesso di osservare un valore di correlazione più elevato con il livello di biocontrollo riscontrato contro marciume radicale in frumento (r = 0.5). Successivamente, al fine di saggiare metaboliti limitanti la produzione di tricoteceni, è stato sviluppato un sistema in micropiastra che misura la fluorescenza emessa da un ceppo di F. graminearum trasformato con il costrutto TRI5::GFP. TRI5 è il primo gene essenziale coinvolto nella via metabolica di produzione di tricoteceni. Da questa prova si è potuto selezionare il ceppo di streptomicete DEF39 che riduce significativamente la produzione di DON. Le potenziali attività di promozione della crescita e di biocontrollo di una selezione dei ceppi più promettenti (N = 21) sono state saggiate in pianta. Gli streptomiceti testati non hanno esibito la capacità di aumentare i parametri di sviluppo dei germinelli di frumento, ma il ceppo DEF09 ha ridotto significativamente il marciume al colletto e la fusariosi della spiga ottenendo livelli di protezioni sopra al 40% e del 60% rispettivamente. Basandosi sui risultati ottenuti, quattro ceppi (DEF09, DEF20, DEF39, DEF48) sono stati applicati su grano sterilizzato testando due tempistiche di trattamento per osservarne la capacità di riduzione della biomassa fungina e della produzione di DON. Inoltre tramite qPCR si è osservata la fitness degli agenti di biocontrollo nelle condizioni testate. Gli streptomiceti, abili colonizzatori del substrato testato, sono stati efficaci nel ridurre la produzione di micotossine, limitando -quando co-inoculati con il patogeno- lo sviluppo dello stesso. I ceppi selezionati agiscono perciò sia contro lo sviluppo fugino e/o contro la produzione di DON. Ulteriori studi saranno necessari per confermarne l’attività in pianta, così come per permettere lo sviluppo di formulati efficaci per limitare la contaminazione da tricoteceni.
PASQUALI, MATIAS
PAGLIARINI, ANTONELLA
PASQUALI, MATIAS
Fusarium head blight (FHB), root rot (FRR) and foot rot (FFR) cause important yield losses in wheat. The harvested product is often contaminated with mycotoxins, belonging to the group of trichothecenes. The main causal agents are Fusarium graminearum, F. culmorum and F. pseudograminearum. The biocontrol approach is a feasible option in order to reduce disease severity, as well as trichothecene contamination in grains. Streptomyces spp. are Gram-positive bacteria, ubiquitous in soil and endophytes of inner tissues of plant roots. They produce a wide range of secondary metabolites able to limit pathogen development and disease severity in planta, as well as to enhance plant growth. This PhD project aimed to select Streptomyces strains active within the wheat-Fusarium spp. pathosystem. To achieve this, a detailed literature and patents analysis focused on biocontrol of toxigenic Fusarium spp. was carried out (Chapter 1) and new methodological approaches for antagonist screening have been developed (Chapter 2). Furthermore, the biocontrol efficacy of a selected subset of strains obtained from the culture collection maintained at the Plant Pathology laboratory (DeFENS, University of Milan, Italy) was evaluated in different conditions (Chapter 3) and bioactive metabolites were isolated (Chapter 4). The influence of growth media and Fusarium strain diversity on streptomycete antifungal activity was assessed in dual culture assays. All the factors influenced the level of antifungal activity. The media commonly used for in vitro screening reduced the inhibitory activity of streptomycetes. Overall, results from dual culture assays and level of disease protection observed in planta did not correlate, except for those recorded on a medium based on wheat grains. Indeed, it was the most effective in eliciting antifungal activity and showed the highest correlation (r = 0.5) with FRR inhibition. Subsequently, being TRI5 the first and essential gene involved in trichothecene biosynthetic pathway in Fusarium spp., a microplate bioassay using a TRI5::GFP transformed F. graminearum strain was developed and validated in order to screen the effect of natural products on GFP fluorescence and consequently on trichothecene production. Surprisingly, culture filtrate from DEF39 strain completely suppressed deoxynivalenol (DON) production without affecting fungal growth. The most promising isolates (N = 21) were further characterized for their potential plant growth promotion ability, as well as for their activity against FRR and FFR in wheat seedlings. None of them was able to increase plant growth. However, DEF09 strain exhibited consistent efficacy to limit FRR-FFR symptom severity (protection level > 40%) in soil and soilless conditions. Therefore, a field trial was performed to test its ability to reduce FHB severity, obtaining up to 60% protection. Based on the activity observed from the previous screenings, four promising streptomycetes (DEF09, DEF20, DEF39, DEF48) were applied on sterilized wheat grains (microsilage) at two timepoints of application, in order to evaluate their ability to suppress fungal growth and DON production. Moreover, the fitness of streptomycetes in microsilage conditions was assessed by qPCR analysis. Streptomycetes were able to efficiently colonize the substrate, which resulted in reducing fungal biomass and DON accumulation only when co-inoculated with the pathogen. A pool of promising biocontrol agents has been selected against fungal development and/or DON production. This research highlighted the complexity of finding an efficient screening procedure due to multiple interactions occurring in wheat-Fusarium spp. pathosystem. Further studies will be needed to confirm the activity of the strains in planta. The identification of the mechanisms of action and the molecules involved in the bioactivity of the strains will possibly allow to develop effective treatments limiting trichothecene accumulation in wheat.
Streptomyces; Fusarium; biocontrol; Fusarium head blight; Fusarium crown rot; wheat; agriculture
Settore AGR/12 - Patologia Vegetale
EXPLORING STREPTOMYCES-FUSARIUM INTERACTION TO HAMPER WHEAT HEAD BLIGHT, CROWN ROT AND DEOXYNIVALENOL PRODUCTION / E.m. Colombo ; supervisor: M. Pasquali ; coordinatore: A. Pagliarini. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE PER GLI ALIMENTI, LA NUTRIZIONE E L'AMBIENTE, 2019 Dec 06. ((32. ciclo, Anno Accademico 2019. [10.13130/colombo-elena-maria_phd2019-12-06].
Doctoral Thesis
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