CAPTURE-BASED NEXT GENERATION SEQUENCING IMPROVES THE IMMUNOGLOBULIN/T-CELL RECEPTOR CLONAL MARKERS IDENTIFICATION IN ADULT ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA PATIENTS LACKING MOLECULAR PROBES

The evaluation of residual leukemia cells during and after treatment (Minimal Residual Disease, MRD) is the strongest prognostic factor in Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). The gold standard for MRD monitoring is the Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) quantitative PCR, which requires at diagnosis the identification of Immunoglobulin/T-Cell Receptor (Ig/TCR) rearrangements as clonality markers. ASO primers are designed based on obtained sequences of V-D-J junction regions, unique for each lymphocyte rearrangement, and employed for MRD assessment. Conventional procedure allows the accurate and sensitive detection of low frequencies leukemic cells (10-5, i.e. 1 leukemic cell among 100000 normal lymphocytes), but this approach is laborious and time-consuming, requiring the development of patient-specific assay conditions. Furthermore, in about 5-10% of cases (defined as MRD-unknown), this method fails to identify suitable markers for MRD evaluation. Recently, alternative amplicon-based Next Generation Sequencing (NGS) techniques have been described for clonality assessment and MRD monitoring in lymphoid malignancies. Although highly sensitive, these approaches are similarly based on the amplification by PCR of selected rearrangements, thus suffering from some restrictions of the conventional method. With the aim to develop a simplified and possibly more efficient method, we designed a capture-based NGS panel targeting the coding regions of V, D and J genes in the Ig/TCR loci, allowing the selection of even uncommon rearrangements and the possibility to combine the Ig/TCR rearrangements detection with the analysis of relevant ALL-related gene alterations. The panel has been validated on 10 diagnostic samples from patients enrolled into the NILG-ALL 09/00 clinical trial, formerly characterized for clonality. By NGS approach, we not only identified correctly all the 51 known Ig/TCR rearrangements, but we also detected 24 additional clonalities, successively confirmed, including rare rearrangements characterized by uncommon V-D-J combinations, oligoclonal rearrangements and low represented clones. Upon validation on well-characterized samples, we applied the NGS approach to retrospectively identify Ig/TCR clonal markers at diagnosis in the cohort of MRD-unknown patients within the NILG-ALL 09/00 clinical trial, in which conventional method failed. Overall, we identified 92 clonal rearrangements, recognizing at least one Ig/TCR rearrangement in 20/23 patients (87%). No Ig/TCR rearrangements were identified for three MRD-unknown patients, all T-lineage. Furthermore, we confirmed the 77% of rearrangements defined by NGS with a level ≥5%, using implemented standard PCR methods or specific oligonucleotides designed on NGS sequences. For the remaining rearrangements, the validation failed because the NGS identified low represented clones or oligoclones, that could not be solved by conventional procedure using family consensus primers. For most cases, designed ASO-qPCR assays based on NGS sequences reached suitable sensitivity for MRD assessment and allowed to correctly follow the leukemia clones, anticipating the hematologic relapse. The majority of patients proved TP53 mutated in a previous work belonged to our MRD unknown cohort since no informative Ig/TCR rearrangements were identified for the design of a suitable patient-specific molecular probe. For these patients, we not only identified at least one Ig/TCR rearrangement by NGS, but we also highlighted the prevalence of incomplete IGH rearrangements. The presence of incomplete IGH rearrangements was investigated in 25 additional TP53 wild-type B-ALL patients for which these clonal rearrangements have not been tested at diagnosis, demonstrating the higher prevalence of incomplete IGH rearrangements in TP53 mutated B-ALL patients, compared to the TP53 wild type counterpart. Finally, thanks to the prospective application of capture NGS approach, we identified at least one rearrangement in 10/12 (83%) newly diagnosed ALL patients MRD-unknown, detecting overall 40 clonal rearrangements. For two T-lineage patients, no Ig/TCR clonal markers have been recognized. Based on sequences provided by NGS, we designed ASO-qPCR assays for the MRD assessment in those cases for which at least one Ig/TCR clonal marker was identified, obtaining at least one highly sensitive patient-specific probe in 50% of cases. For two patients for which follow-up samples were available, we used the designed probes to proceed with the MRD assessment, thus ensuring the correct allocation of patients in the most adequate risk-category. The capture NGS panel, targeting both Ig/TCR loci and ALL-related genes, was validated on diagnostic material from 7 adult ALL patients formerly evaluated for Ig/TCR rearrangements and prospectively tested on the 12 newly diagnosed ALL patients MRD-unknown. Overall, we identified 51 gene variants in 18/19 (94.7%) analyzed patients. In all the B-ALL patients we identified single variants involving exclusively one gene (CREBBP, FLT3, JAK2, PAX5, and TP53), while the only T-ALL patient showing a single mutated gene (PTEN) harbored simultaneously two mutations. Indeed, in the remaining T-ALL cases, we identified the presence of gene variants involving at least two genes and we observed a statistically significant correlation between the T-lineage and the increase of the mutations number per patient (p=0.0282). Of note, from 2 to 5 gene variants were identified in three patients in which no Ig/TCR rearrangements were recognized, thus the risk-category of the patients has not been molecularly determined. Since the Ig/TCR rearrangements represent surrogate for stable, easy to identify leukemia clonal markers, the mutated gene alterations could represent, in these latter cases, a molecular signature for MRD analysis with alternative methods or for targeted therapy. In conclusion, the developed capture-based NGS assay allowed the identification of clonal rearrangements in most cases in which standard approach failed, detecting also rare, oligoclonal and low represented rearrangements, not isolated by conventional methods. Therefore, NGS can be of high value in patients with rare rearrangements, suitable for MRD evaluation and MRD-driven treatment. Furthermore, the NGS technology proved useful in identifying minor leukemia clones at diagnosis, so anticipating possible unexpected relapses in patients negative for major clones. In summary, our results suggest that the prospective application of this technology could simplify clonality assessment and improve standard assays development for leukemia monitoring, also providing information about the mutational status of ALL-related genes.

La valutazione della presenza di cellule leucemiche residue durante e dopo il trattamento (malattia residua minima o Minimal Residual Disease, MRD) è il principale fattore prognostico nella Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL). Il gold standard per il monitoraggio della MRD è rappresentato dalla PCR quantitativa con oligonucleotidi allele-specifici (ASO), che richiede l’identificazione alla diagnosi dei riarrangiamenti di Immunoglobuline/T-Cell Receptor (Ig/TCR) quali marcatori di clonalità. I primers ASO sono disegnati sulla base delle sequenze delle regioni giunzionali V-D-J identificate, peculiari per ogni riarrangiamento linfocitario, e utilizzati per la valutazione della MRD. La procedura convenzionale permette l’individuazione accurata e sensibile di cellule leucemiche a bassa frequenza (10-5, i.e. 1 cellula leucemica in un contesto di 100000 linfociti normali), tuttavia tale approccio è laborioso e dispendioso in termini di tempo, poiché richiede la messa a punto di condizioni sperimentali paziente-specifiche. Inoltre, in circa il 5-10% dei casi (definiti come MRD-unknown), questo metodo fallisce nell’identificazione di adeguati marcatori per la valutazione della MRD. Recentemente sono state descritte tecniche alternative di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) ad ampliconi per la valutazione della clonalità e il monitoraggio della MRD nelle neoplasie linfoidi. Sebbene altamente sensibili, questi approcci sono anch’essi basati sull’amplificazione tramite PCR di riarrangiamenti selezionati, pertanto sono soggetti ad alcuni limiti della metodica convenzionale. Al fine di sviluppare un metodo semplificato e possibilmente più efficiente, abbiamo disegnato un pannello NGS diretto sulle regioni codificanti dei geni V, D e J nei loci di Ig/TCR, che permette la selezione anche dei riarrangiamenti rari e la possibilità di combinare l’individuazione dei riarrangiamenti di Ig/TCR con l’analisi di rilevanti alterazioni geniche LAL- correlate. Il pannello è stato validato utilizzando 10 campioni prelevati alla diagnosi da pazienti arruolati nel protocollo clinico NILG-ALL 09/00, precedentemente analizzati per la clonalità. Mediante l’approccio NGS, non solo abbiamo identificato correttamente tutti i 51 riarrangiamenti Ig/TCR noti, ma abbiamo anche individuato 24 ulteriori clonalità, successivamente confermate, compresi riarrangiamenti rari, oligoclonali e cloni minoritari. Dopo la validazione sui campioni precedentemente studiati, abbiamo applicato l’approccio NGS per l’identificazione retrospettiva di marcatori clonali Ig/TCR alla diagnosi nella coorte di pazienti MRD-unknown, all’interno del protocollo NILG-ALL 09/00, in cui la metodica convenzionale aveva fallito. Nel complesso abbiamo identificato 92 riarrangiamenti clonali, individuando almeno un riarrangiamento Ig/TCR in 20/23 pazienti (87%). Per tre pazienti MRD-unknown, tutti di lineage T, non sono stati identificati riarrangiamenti Ig/TCR. Inoltre, abbiamo confermato il 77% dei riarrangiamenti definiti tramite NGS ad un livello ≥5%, utilizzando metodiche di PCR standard implementate o oligonucleotidi specifici disegnati sulla base delle sequenze derivanti da NGS. Per i restanti riarrangiamenti, la validazione è fallita in quanto la metodica NGS ha individuato cloni minoritari o oligocloni, che non possono essere discriminati tramite procedura convenzionale che utilizza primers consensus famiglia-specifici. Nella maggior parte dei casi, i saggi di ASO-qPCR disegnati sulla base delle sequenze derivanti da NGS hanno raggiunto la sensibilità richiesta per la valutazione di MRD ed hanno permesso di seguire l’andamento dei cloni leucemici, anticipando la recidiva ematologica. La maggior parte dei pazienti risultati mutati per TP53 in un precedente studio, apparteneva alla nostra coorte di pazienti MRD-unknown, in quanto non erano stati individuati riarrangiamenti Ig/TCR informativi e utili per il disegno di sonde molecolari paziente-specifiche. Per questi pazienti, non solo abbiamo identificato mediante NGS almeno un riarrangiamento Ig/TCR, ma abbiamo anche messo in luce la prevalenza di riarrangiamenti IGH incompleti. La presenza di riarrangiamenti IGH incompleti è stata inoltre analizzata in ulteriori 25 pazienti affetti da LAL non mutati per TP53, per i quali questo tipo di riarrangiamenti clonali non era stato testato alla diagnosi, dimostrando la maggior prevalenza di riarrangiamenti IGH incompleti nei pazienti affetti da LAL-B mutati in TP53, rispetto alla controparte non mutata. Infine, grazie all’applicazione prospettiva dell’approccio di NGS a cattura, abbiamo identificato almeno un riarrangiamento in 10/12 (83%) nuove diagnosi di pazienti MRD-unknown affetti da LAL, identificando nel complesso 40 riarrangiamenti clonali. Per due pazienti T-lineage non sono stati individuati marcatori clonali Ig/TCR. Sulla base delle sequenze ottenute tramite NGS, abbiamo disegnato saggi ASO-qPCR per la valutazione di MRD per quei casi in cui era stato identificato almeno un marcatore clonale Ig/TCR, ottenendo almeno una sonda paziente-specifica altamente sensibile nel 50% dei casi. Per due pazienti per cui erano disponibili campioni relativi al follow-up abbiamo utilizzato le sonde disegnate per procedere con la valutazione di MRD, assicurando l’allocazione dei pazienti nella categoria di rischio più adeguata. Il pannello di NGS a cattura che includeva sia i loci Ig/TCR sia i geni correlati a LAL è stato validato utilizzando materiale diagnostico derivante da 7 pazienti adulti affetti da LAL precedentemente studiati per i riarrangiamenti Ig/TCR ed è stato testato in prospettico sui 12 pazienti affetti da LAL MRD-unknown di nuova diagnosi. Globalmente abbiamo identificato 51 varianti geniche in 18/19 (94.7%) pazienti analizzati. In tutti i pazienti affetti da LAL-B abbiamo identificato singole varianti su un unico gene (CREBBP, FLT3, JAK2, PAX5 e TP53), mentre il solo paziente affetto da LAL-T con un solo gene mutato (PTEN) è risultato avere due mutazioni concomitanti. Infatti, nei restanti casi di LAL-T abbiamo identificato la presenza di varianti geniche a carico di almeno due geni e abbiamo osservato una correlazione statisticamente significativa tra il lineage T e l’aumento del numero di mutazioni per paziente (p=0.0282). Degna di nota è l’identificazione di varianti geniche (da 2 a 5) in tre pazienti in cui non erano stati identificati riarrangiamenti Ig/TCR, pertanto la categoria di rischio dei pazienti non era stata determinata molecolarmente. Dal momento che i riarrangiamenti Ig/TCR rappresentano un surrogato di marcatori clonali leucemici stabili e facilmente identificabili, le alterazioni dei geni mutati potrebbero rappresentare, in questi casi, la signature molecolare per l’analisi di MRD con metodi alternativi o per la terapia mirata. In conclusione, il saggio di NGS a cattura sviluppato ha permesso l’identificazione di riarrangiamenti clonali nella maggior parte dei casi in cui l’approccio standard aveva fallito, individuando anche riarrangiamenti rari, oligoclonali e poco rappresentati, non isolati mediante metodiche convenzionali. Quindi l’NGS può essere di grande valore nei pazienti con riarrangiamenti rari, adeguati per la valutazione della MRD e il trattamento da essa indirizzato. Inoltre la tecnologia NGS è risultata utile nell’identificazione di cloni leucemici minoritari alla diagnosi, anticipando una possibile recidiva inattesa in pazienti negativi per i cloni maggioritari. In sintesi, i nostri risultati suggeriscono che l’applicazione prospettica di questa tecnologia potrebbe semplificare la valutazione della clonalità e migliorare lo sviluppo di saggi standard per il monitoraggio della leucemia, fornendo inoltre informazioni circa lo stato mutazionale di geni correlati a LAL.