IDENTIFICATION OF THE ANTIGEN RECOGNIZED BY RHIGM22, A REMYELINATION-PROMOTING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY

All eukaryotic cells are surrounded by a cellular membrane that functions as a barrier between subcellular compartments and between the cell and its environment. In addition to proteins, they are composed by three different set of lipids: glycerolipids, sphingolipids and sterols. Glycerolipids are the major components of cell membranes and they are produced using phosphatidic acid (PtdOH) as a central precursor. Instead, sphingolipids (SLs), the minor cell components, have sphingosine as basic building block; the additions of oligosaccharides to sphingosine giving rise glycosphingolipids (GSLs). SLs and GSLs are not distribute homogeneously in the outer plasma membrane. They form small, heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains, called “lipid rafts”; in these semiordered lipid microdomains, SLs are involved in cell adhesion/recognition processes and signal transduction pathway. The organ with the highest enrichment in lipids such as cholesterol e glycosphingolipids, is the brain. Myelin, the fatty white substance that surrounds the axon of nerve cells, is characterized by a high lipid-to-protein ratio, where lipids representing 80% of its dry weight. The myelin membrane contains a high level of two galactosphingolipids, galactosylceramide (GalCer) and 3-O-sulfogalactosylceramide (sulfatide), account for about 20 and 5 % of myelin lipids respectively. The specific roles of GalCer and sulfatide seem to be linked to their ability to form and to stabilize specific lateral domains in the membrane of myelin forming-cells and in the myelin sheath, that regulate the correct sorting, trafficking, co-clustering and lateral distribution of the major myelin proteins. Recent reports have suggested that some of the myelin-specific lipids may be key contributors to the pathogenic mechanism of multiple sclerosis (MS), the most common demyelinating disease in the CNS. Individuals with MS disease are reported to have different myelin lipid compositions and elevated levels of anti-sulfatide Ab in biological fluids compared with healthy individuals. On the other hand, anti-myelin antibodies might represent an important immunological tool for the treatment of neurological diseases involving myelin lesions. In particular, it has been shown that human monoclonal antibodies that bind myelin and oligodendrocytes (OLs), as rHIgM22, can initiate dramatic increase in remyelination in animal models of demyelination. Nowadays, the exact mechanism of action of rHIgM22 remains to be elucidated, but some evidence suggest that the mechanism is correlated with the organization of lipid rafts on the surface of myelin and OLs. The experiments described in this thesis were aimed at the individuation of the molecular target(s) of the antibody and at the characterization of its membrane microenvironment, in order to better understand the characteristics of rHIgM22 and its remyelinating activity. The binding of rHIgM22 to purified lipids and to lipid extracts from various sources were tested using TLC immunostaining assays and SPR assays. The results obtained show that rHIgM22 binds to sulfatide, and, to a lesser extent, to lysosulfatide in vitro, while it does not bind to other myelin sphingolipids. The binding affinity for both sulfatide and its deacylated derivate is low, even if the binding is specific. On the other hand, our data shows that the binding affinity of rHIgM22 for sulfatide can be modulated by the presence of other lipids suggesting a possible role of the membrane microenvironment in the recognition of the antigen by rHIgM22. In addition, rHIgM22 also reacts with phosphatidic acid, phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS). To verify whether rHIgM22 can bind sulfatide or other lipids, the binding of rHIgM22 was tested not only to purified lipids, but also to partially purified lipid extracts obtained from wild type, ASM (-/-), CST (+/-) and CST (-/-) mice brains, mouse mixed glial cells (MGC), mouse astrocytes, rat rHIgM22+ OLs, rat microglia, and mouse myelin. In TLC immunostaining experiments for aqueous phases, we observed rHIgM22-immunoreactive bands co-migrating with the pure sulfatide standard and, unexpectedly, a second rHIgM22-immunoreactive band migrating below sulfated, co-migrating with the pure phosphatidylinositol and phosphatidylserine standard, confirming the TLC immunostraining data to purified lipids. The identity of phospholipid species has been confirmed by ESI mass spectrometry experiments; they show that phosphatidylinositol was an 18:0/20:4-PI and phosphatidylserine was 18:0/22:6-PS and 18:0/18:1-PS. In addition, MS analysis for the fractions enriched in sulfatide, shows that rHIgM22 can bind different sulfated species suggesting that this binding is not fatty acid species-specific for the sulfatide. All these data suggest that not only sulfatide, but also other membrane lipids might play a role in the binding of rHIgM22 to OLs or to other cell types. Moreover, the antigen recognized by rHIgM22 could be associated with plasma membrane lipid rafts in these cells and this target could be including in a multimolecular complex. The identification of the binding target(s) of a rHIgM22, and the characterization of their membrane microenvironment, could greatly contribute to the elucidation of the signaling mechanisms underlying the remyelination promoting activity of this antibody and also of those involved in MS etiology, allowing to define new potential therapeutic strategies.

Tutte le cellule eucariotiche sono circondate da una membrana cellulare che funge da barriera tra i compartimenti subcellulari e tra la cellula e il suo ambiente. Oltre alle proteine, le membrane cellulari sono composte da tre diversi gruppi di lipidi: glicerolipidi, sfingolipidi e steroli. I glicerolipidi sono i principali componenti delle membrane cellulari e sono prodotti utilizzando acido fosfatidico (PtdOH) come precursore centrale. Invece, gli sfingolipidi (SL), i componenti cellulari minori, hanno la sfingosina come componente base; l’aggiunta di oligosaccaridi alla sfingosina da origine agli glicosfingolipidi (GSL). SL e GSL non si distribuiscono in modo omogeneo nella membrana plasmatica esterna. Formano domini piccoli, eterogenei, altamente dinamici, arricchiti con steroli e sfingolipidi, chiamati "zattere lipidiche"; in questi microdomini semiordinati, gli SL sono coinvolti i diversi processi, quali quelli di adesione, riconoscimento e trasduzione del segnale. L'organo con il più alto arricchimento di lipidi, come colesterolo e glicosfingolipidi, è il cervello. La mielina, la sostanza isolante che circonda l'assone delle cellule nervose, è caratterizzata da un elevato rapporto lipidi-proteine, in cui i lipidi rappresentano l'80% del suo peso secco. Questa membrana contiene un alto livello di due galattosfingolipidi in particolare, il galattosilceramide (GalCer) e il 3-O-sulfogalattosilceramide (solfatide), che rappresentano rispettivamente circa il 20 e il 5% dei lipidi mielinici. I ruoli specifici di GalCer e solfatide sembrano essere legati alla loro capacità di formare e stabilizzare specifici domini laterali nella membrana mielinica, che regolano il corretto smistamento, traffico, co-clustering e distribuzione laterale delle principali proteine della mielina. Studi recenti hanno suggerito che alcuni lipidi specifici della mielina potrebbero essere i principali responsabili del meccanismo patogeno della sclerosi multipla (SM), la malattia demielinizzante più comune nel sistema nervoso centrale. Gli individui affetti da SM hanno un’alterata composizione lipidica della mielina e elevati livelli di anticorpi anti-solfatide, nei fluidi biologici, rispetto agli individui sani. D'altro canto, gli anticorpi anti-mielina potrebbero rappresentare un importante strumento immunologico per il trattamento di malattie neurologiche che coinvolgono lesioni mieliniche. In particolare, è stato dimostrato che gli anticorpi monoclonali umani che legano la mielina e gli oligodendrociti (OL), come rHIgM22, possono stimolare un meccanismo di rimielinizzazione nei modelli animali di demielinizzazione. Ad oggi, l'esatto meccanismo d'azione di rHIgM22 resta da chiarire, ma alcune prove suggeriscono che il meccanismo è correlato all'organizzazione delle zattere lipidiche presenti sulla superficie della mielina e degli OL. Lo scopo degli esperimenti descritti in questa tesi è quello di individuare i target molecolari dell'anticorpo e caratterizzare il microambiente di membrana in cui si trova, al fine di comprendere meglio l’ attività rimielinizzante di rHIgM22. Il legame di rHIgM22 ai lipidi purificati e agli estratti lipidici da varie fonti è stato testato usando saggi di TLC Immunostaining e saggi SPR. I risultati ottenuti mostrano che rHIgM22 si lega al solfatide e, in misura minore, al lisosolfatide in vitro, mentre non si lega ad altri sfingolipidi della mielina. L'affinità di legame sia per il solfatide che per il suo derivato deacilato è bassa, anche se il legame è specifico. In aggiunta, i nostri dati mostrano che l'affinità di legame di rHIgM22 per solfatide può essere modulata dalla presenza di altri lipidi, suggerendo un possibile ruolo del microambiente di membrana nel riconoscimento dell'antigene da parte di rHIgM22. Inoltre, rHIgM22 reagisce anche con acido fosfatidico, fosfatidilinositolo (PI) e fosfatidilserina (PS). Per verificare la capacità di rHIgM22 di legare sulfatide o altri lipidi, il legame di rHIgM22 è stato testato anche su estratti lipidici purificati da diversi campioni: cervelli di topo WT, ASM (- / -), CST (+/-) e CST (- / -), cellule gliali miste di topo (MGC), astrociti di topo, rHIgM22+ OLs di ratto, microglia di ratto e mielina di topo. Negli esperimenti di TLC Immunostaining per le fasi acquose di questi campioni, abbiamo osservato bande immunoreattive a rHIgM22 che co-migrano con lo standard di solfatide puro e, inaspettatamente, una seconda banda immunoreattiva a rHIgM22 co-migrante con lo standard fosfatidilinositolo e fosfatidilserina puro, confermando i dati di TLC Immunostaining sui lipidi purificati. L'identità delle specie fosfolipidiche riconosciute da rHIgM22 è stata confermata tramite spettrometria di massa; gli spettri mostrano che la specie molecolare del fosfatidilinositolo è 18:0/20:4, mentre per la fosfatidilserina è 18:0/22:6 e 18:0/18:1. Inoltre, l'analisi tramite spettrometria di massa per le frazioni arricchite in solfatide, mostra che rHIgM22 può legare diverse specie solfatate, suggerendo che questo legame non è specifico alle diverse specie degli acidi grassi. Tutti questi dati suggeriscono che non solo il solfatide, ma anche altri lipidi di membrana possono avere un ruolo nel legame di rHIgM22 agli OL o ad altri tipi di cellule. Inoltre, l'antigene riconosciuto da rHIgM22 potrebbe essere associato a zattere lipidiche di membrana plasmatica e incluso in un complesso multimolecolare. L'identificazione dei target riconosciuti da rHIgM22 e la caratterizzazione del microambiente di membrana in cui si trovano, potrebbe contribuire notevolmente a chiarire i meccanismi di segnalazione coinvolti nell'attività di promozione della rimielinizzazione di questo anticorpo, ma anche di quelli coinvolti nell'eziologia della SM, permettendo di identificare nuove potenziali strategie terapeutiche.