LAMINOPATHIES: PATHOLOGY, CELL MECHANICS ANDENVIRONMENTAL INDUCTION.

ABSTRACT The nuclear lamina (NL) is a fibrillary protein network lining the inner surface of the nuclear envelope. It is mainly composed by type V intermediate filaments called lamins and lamin-associated proteins. Three lamin genes are present in Mammals: LMNA, which encodes lamin A and lamin C (Atype lamins), as well as, LMNB1 and LMNB2 that encode lamin B1 and B2 (B-type lamins) respectively. Lamins and LAPs associate to form a dense and dynamic three-dimensional matrix that establishes a huge number of stable and transient interactions with different classes of molecules: DNA, transcription factors, nuclear pore complexes and structural proteins of the cytoskeleton. All of these interactions are essential to provide nuclear structural stability and integrity, to physically and functionally link nuclear lamina to the cytoskeleton and to organizes chromatin. Thus NL, in addition to play a fundamental structural role, it is also a key player in cellular mechanotransduction processes and gene expression and epigenetic regulation. Mutations in genes encoding for lamins are associated with a wide a range of diseases, named laminopathies. Among these, the most interesting one is Hutchison-Gilford Progeria Syndrome (HGPS), a rare fatal genetic disorder due to do a point mutation in LMNA. This mutation results in the production of a truncated version of lamina A, lacking 50 amino acids, known as Progerin. HGPS is mainly characterized by morphological changes in the nucleus and premature aging. HGPS patients indeed, from their first years of life, develop pathological conditions typical of the elderly such as cataracts, diabetes and osteoporosis while preserving the normal cognitive functions. These patients typically die from cardiovascular complications around 14 years of age, on average. Considering Hutchinson-Guilford Progeria Syndrome as an extreme example of what nuclear lamina aberration entails, during my PhD I investigated many aspects of nuclear lamina biology with particular regard to the impact of nuclear lamina structural perturbations on cell functions, mechanics, gene expression regulation and the interconnection existing between nuclear lamina integrity, ageing process and oxidative stress. Indeed, to gain a comprehensive picture of nuclear lamina biology in health and disease, it has been adopted interdisciplinary and integrative research strategies able to take into account structural, mechanical and molecular aspects. Bioinformatics study has been performed: public available transcriptomic data of HGPS patients have been analysed with respect of those of healthy matched controls. This analysis allowed to delineate the typical global gene expression profile of HGPS patients and to identify all the deregulated pathways in the presence of the pathology. Moreover, impacts of lamina alterations on its physical and functional connections with extra-nuclear and nuclear elements have been studied in an inducible expression cellular model of the mutated form of Lamin A responsible for HGPS. This cellular model faithfully recapitulates the peculiar cellular phenotype of the HGPS patients resulting to be a valid alternative to primary cell lines deriving from the patients.Finally, the interdependence between oxidative stress, ageing and lamins has been investigated in a novel oxidative stress cellular model developed in our laboratory, that is also efficient in recapitulating typical ageing profile.

La lamina nucleare (NL) è un reticolo di proteine fibrillari che riveste la superficie interna della membrana nucleare. Essa è principalmente composta da filamenti intermedi di tipo V , chiamati lamìne, e proteine ausiliari ad esse associate (lamin-associated proteins, LAPs). Nei mammiferi le lamìne sono codificate da tre geni : LMNA, che codifica per la lamìna A e lamìna C (lamìne di tipo A), LMNB1 e LMNB2 che codificano rispettivamente per la lamìna B1 e B2 (lamìne di tipo B). Lamìne e LAPs si associano a formare una matrice tridimensionale densa e dinamica che stabilisce numerose interazioni, sia stabili che transitorie, con diverse classi di molecole biologiche: DNA, fattori di trascrizione, proteine strutturali. Tutte queste interazioni sono essenziali per fornire stabilità strutturale e preservare l’integrità nucleare, per collegare fisicamente e funzionalmente la lamina nucleare al citoscheletro e per organizzare la cromatina. In questo modo, oltre a svolgere un ruolo strutturale fondamentale, la lamina nucleare risulta ricoprire ruoli chiave anche nei processi di meccanotrasduzione del segnale e nella regolazione dell’espressione genica ed epigenetica. Mutazioni a carico dei geni che codificano per le lamìne nucleari sono associate ad un'ampia ed etogenea classe di patologie note come laminopatie. Tra queste, una delle più controverse ed interessanti è la Hutchison-Gillford Progeria Syndrome (HGPS), una malattia genetica rara dovuta a una mutazione puntiforme nel gene LMNA. Tale mutazione risulta nella produzione di una versione tronca della lamìna A, mancante di 50 amminoacidi, conosciuta come Progerina. HGPS è principalmente caratterizzata da alterazioni morfologiche del nucleo e invecchiamento precoce. I soggetti affetti da Progeria, infatti, fin dai primi anni di vita sviluppano condizioni patologiche tipiche dell’età senile quali cataratta, diabete e l'osteoporosi pur preservando le normali funzioni congnitive. Questi pazienti muoiono tipicamente per complicanze cardiovascolari intorno ai 14 anni di età, in media. Considerando la sindrome di Hutchinson-Guilford come un esempio estremo di ciò che alterazioni della lamina nucleare comportano, durante il mio dottorato di ricerca ho investigato diversi aspetti riguardanti la biologia della lamina nucleare con particolare interesse all'impatto che perturbazioni strutturali della lamina nucleare possono avere sulle normali funzioni cellulari, la meccanica cellulare, la regolazione dell'espressione genica e l’ interconnessione esistente tra integrità della lamina nucleare, processo di invecchiamento e stress ossidativo. Per ottenere una visione d’insieme del contributo della lamina nucleare sia in condizioni fisiologiche che patologiche, sono state adottate strategie di ricerca basate su approcci interdisciplinari e integrativi in grado di tenere conto degli aspetti strutturali, meccanici e molecolari. Per fa questo, in prima instanza sono state effetuate delle analisi bionformatiche: tutti i dati di trascrittomica relativi a pazienti HGPS, presenti in database pubblici e in letteratura, sono stati raccolti e analizzati rispetto a dati equivalenti ottenuti da controlli sani. Tale analisi ha permesso di delineare profilo di espressione genica tipico di pazienti HGPS e di individuare i pathways deregolati in presenza della patologia. È stato inoltre studiato l’impatto che alterazioni della lamina nucleare hanno sulle connessioni fisiche e funzionali che questa stabilisce sia con elementi nucleari ed extra-nucleari, in un modello cellulare in cui è possibile indurre sperimentalmente, in modo controllato, l’espressione della forma mutata di Lamìn A responsabile dell’ HGPS. Tale modello cellulare ricapitola fedelmente il peculiare fenotipo cellulare dei pazienti risultando essere una valida alternativa all’utilizzo di linee primarie derivanti dai pazienti. Infine, l'interdipendenza tra stress ossidativo, invecchiamento e lamìne nucleari è stata investigata in un nuovo modello cellulare di stress ossidativo sviluppato nel nostro laboratorio, efficiente nel ricapitolare il processo di invecchiamento, in vitro.