PLEIOTROPIC PHENOTYPE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA MUTANTS DEFECTIVE IN GLUCOSE UPTAKE

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen causing a wide range of infections in humans. Pathologies leading to hyperglycaemia have been associated with augmented risk of developing serious P. aeruginosa infections due to the ability of the bacterium to utilize glucose as carbon source for the growth. Therefore, preventing the import of glucose might be a good strategy to develop anti-pseudomonas drugs. To address this hypothesis, a collection of single and multiple glucose uptake defective mutants was generated in P. aeruginosa PAO1 and tested for virulence-related phenotypes in in vitro assays and in vivo, in two different infection models. In particular, we engineered mutants in genes encoding inner membrane (IM) proteins involved in the internalization of glucose and its oxidized derivatives gluconate and 2-ketogluconate, i.e. the Glt, GntP and KguT transporters. A triple mutant lacking these transporters was demonstrated to be completely unable to grow on glucose as sole carbon source (Glucose Uptake Null mutant, GUN). The transcriptomic analysis revealed a strong divergence in the GUN transcriptional profile relative to the parental strain, with more than 500 differentially expressed genes, controlling both metabolic functions and virulence traits. Consistent with the transcriptomic data, the GUN mutant showed a pleiotropic phenotype in the in vitro assays, with a reduction in biofilm formation and an increased secretion of proteases, pyocyanin and pyoverdine. Furthermore, the production of quorum sensing signal molecules was altered in this mutant. Interestingly, the gene expression profile and most phenotypic traits differ between GUN and the parental strain irrespective of the presence of glucose, suggesting a possible additional role for the deleted transporter(s). Finally, the in vivo assays demonstrated that while the virulence of all mutants in the Caenorhabditis elegans infection model was essentially comparable to that of the wild type strain, all mutants lacking kguT (i.e. the 2-ketogluconate transporter gene) and especially the double ΔgntP ΔkguT and GUN mutants, were attenuated in the Galleria mellonella model. This suggests that targeting glucose metabolism with specific drugs may alter P. aeruginosa pathogenicity depending on the ability of this pathogen to adapt to the specific nutritional context encountered at the site of infection. Therefore, a deeper knowledge of host-pathogen metabolic transactions is pivotal to develop effective antibacterial strategies based on hampering bacterial metabolic functions.

Pseudomonas aeruginosa è un patogeno opportunista che provoca una vasta gamma di infezioni nell’uomo. È noto che l’incidenza delle infezioni da P. aeruginosa è maggiore in persone che presentano elevati livelli di glucosio nel sangue, a causa della capacità del batterio di utilizzare il glucosio in eccesso come nutriente per la crescita. Pertanto, bloccare l’attività di proteine coinvolte nel trasporto o nell’utilizzazione del glucosio da parte del batterio potrebbe essere una buona strategia per lo sviluppo di farmaci anti-pseudomonas. Per valutare questa ipotesi, abbiamo costruito una serie di mutanti singoli e multipli difettivi nel trasporto del glucosio nel ceppo PAO1 di P. aeruginosa e li abbiamo analizzati per fenotipi correlati alla virulenza in saggi in vitro e in vivo, in due differenti modelli di infezione. In particolare, sono stati deleti i geni codificanti per i trasportatori della membrana interna Glt, GntP e Kgut, che mediano l’ingresso del glucosio e dei suoi derivati ossidati gluconato e 2-ketogluconato. Un triplo mutante privo dei suddetti trasportatori si è rivelato incapace di crescere su glucosio come unica fonte di carbonio (mutante GUN, Glucose Uptake Null). Più di 500 geni, che controllano sia funzioni metaboliche che la virulenza, sono espressi in modo differenziale nel mutante GUN rispetto al ceppo parentale. Coerentemente con i dati dell’analisi trascrittomica, i saggi di virulenza in vitro hanno mostrato che il mutante GUN si comporta diversamente dal ceppo parentale, avendo una ridotta capacità di formare biofilm e una maggiore secrezione di proteasi, piocianina e pioverdina. Inoltre, questo mutante ha una produzione alterata delle molecole segnale che attivano il sistema del quorum sensing. È interessante notare che il profilo trascrizionale e la maggior parte dei tratti fenotipici analizzati differiscono tra il mutante GUN e il ceppo parentale indipendentemente dalla presenza del glucosio, suggerendo che uno (o più) dei trasportatori deleti abbia una funzione addizionale non correlata al trasporto del glucosio. Infine, alcuni mutanti hanno mostrato un diverso grado di virulenza in saggi di infezione negli ospiti modello Caenorhabditis elegans e Galleria mellonella. In particolare, mentre in C. elegans la virulenza dei mutanti è risultata simile a quella del ceppo parentale PAO1, i mutanti deleti del gene kguT, che codifica per il trasportatore del 2-ketogluconato, sono meno virulenti di PAO1 in G. mellonella. L’attenuazione è particolarmente significativa per il doppio mutante ΔgntP ΔkguT e per il mutante GUN. Questo risultato suggerisce che l’efficacia antibatterica di composti che bloccano l’utilizzo del glucosio da parte di P. aeruginosa potrebbe presumibilmente variare a seconda della capacità del patogeno di adattarsi allo specifico contesto nutrizionale dell’ospite infettato. Una maggiore conoscenza delle interazioni metaboliche che avvengono tra patogeno ed ospite nel sito d’infezione diventa quindi sempre più necessaria per poter sviluppare terapie antibatteriche efficaci.