GENETIC, BIOCHEMICAL AND NUTRITIONAL MARKERS OF CARDIOVASCULAR EVENTS IN CHRONIC KIDNEY DISEASE PATIENTS

Introduction. Chronic Kidney Disease (CKD) patients at different stages suffer of high risk of cardiovascular mortality, which is higher than the age-matched general population. In fact, cardiovascular disease (CVD) is the first cause of death in CKD patients because of the simultaneous presence of the classical risk factors and the ones specific of the renal disease, among which there are metabolic mineral disorders. The long-term complications include hyperparathyroidism and hyperphosphatemia that are linked to an increase of FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) serum level. FGF23 is a growth factor produced by the bone tissue that acts to reduce the level of serum phosphate. Literature reports that a prolonged exposure to phosphate intake increases FGF23 production. Data show a link between FGF23 and hyperphosphatemia with an increased risk of CVD. A dietary restriction of phosphate can be useful to fight against cardiovascular morbidity and vascular calcifications. Another interesting bone metabolism marker is sclerostin, a protein produced by osteocytes having an inhibitory activity on bone formation and its production is increased in CKD patients. The current study is called "The Cardiovascular Mortality project: study of functional markers" (CREMA) and aims to investigate cardiovascular mortality by identifying the genetic, biochemical and functional markers of arterial damage in relation to the diet. The project is a longitudinal observational study. Recruited patients were followed for a 5-year follow-up period. The main purpose of the study was to identify the genetic factors predisposing the risk of occurrence of cardiovascular events in CKD and, together with these, the nutritional and biochemical factors that could influence the development and progression of cardiovascular events. Population and Methods. The current study recruited 332 CKD patients, both in pre-dialysis and in hemodialysis (HD) and collected dietary 24hrs recalls, medical history, biochemical and instrumental parameters and blood samples for genetic analysis. SNPs genotyping was performed in 208 HD patients using Illumina® MegaEX Array (2M SNPs) comparing patients with previous cardiovascular events (CV1; 135 subjects) to patients without cardiovascular events (CV0; 73 subjects). For each marker, we calculated the Fixation Index (Fst) using the CV1 and CV0 as subpopulations in order to identify the most differentiated SNPs between the two subgroups. Using the cut-off of the 99th percentile of the Fst distribution we identified 3218 SNPs as differentiated between CV1 and CV0. We interrogated two functional pathway tools (Panther and Ingenuity Pathway Analysis - IPA) to define any possible biological/pathological role of the associated SNPs. Results. We observed that HD patients had lower body weight, lower calcium and lower vitamin D serum and higher phosphatemia, PTH and FGF23 than pre-dialysis CKD patients at stage 3-5. Multiple linear regression showed positive correlation between serum phosphate, FGF23 and PTH in both HD and pre-dialysis CKD patients, while a negative correlation between phosphorous intake and serum phosphate was found. Probably this is due to the effect of FGF23. The sample was split in three sets based on phosphate intake. Serum FGF23 was evaluated for the three sets. For HD patients, FGF23 serum level increases with an increase of phosphate, whereas in pre-dialysis CKD patients this relation is not observed. Moreover, risk factors linked to CVD were evaluated for our sample. A Cox regression analysis on the sample showed that a high dietary phosphate intake (> 1200 mg/die) increases the risk of cardiovascular events. Serum sclerostin was increased in 87 patients with CKD and its increase was proportional to estimated glomerular filtration rate (eGFR) decline. Considering tertiles of serum sclerostin, patients in the highest tertile showed lower GFR and 1,25(OH)2D serum values and higher FGF23 serum values than in patients in the lowest tertile. Lumbar-spine bone mineral density (BMD) z-score was greater in patients in the highest and the middle tertiles, taken together, than in patients in the lowest tertile. Patients not-taking calcitriol as chronic therapy (n=60) had higher eGFR and lower serum sclerostin than patients chronically treated with calcitriol. Multiple stepwise regression showed that serum sclerostin was negatively associated with serum 1,25(OH)2D and positively with serum FGF23 in the whole patient sample and in patients not-taking calcitriol. Multiple stepwise regression also showed that only serum sclerostin was positively associated with BMD z-score in all participants and patients not-taking calcitriol. Aorta calcification score and cardiovascular events were not associated with serum sclerostin. For the genetic analysis, we merged the most significant results from the two tools and we identified two genes involved in both cardiovascular disease pathways (from IPA) and hearth development (Panther): Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP1R) and Sarcoglycan delta (SGCD). Using regression tree analysis, we found that GLP1R rs10305445 minor allele A is associated with higher percentages of CV1 (p=0.03) and, inversely, SGCD rs145292439 minor allele A is associated with lower percentages of CV1 (p=0.038) and higher levels of HDL (p=0.015). Nutrition evaluation was conducted on 148 subjects (98 in hemodialysis and 50 in pre-dialysis). The analyses showed a positive correlation between the stage of the disease and the intake of vitamin E, while it had a negative correlation with beta-carotene intake. However, no significant correlations have been observed between the analysis of the collected nutritional data and the conducted genetic analyses. Conclusions. Serum FGF23 levels increase with high dietary phosphate intake (>1200 mg/die) in HD patients. HD patients have a higher intake of phosphate than pre-dialysis CKD patients at stage 3-5. FGF23 is mainly influenced by phosphate dietary intake in hemodialysis patients. Moreover, a high dietary phosphate intake (>1200 mg/die) increases the risk of cardiovascular events during all stages of CKD. Our findings suggest that serum sclerostin may be a determinant of 1,25(OH)2D synthesis and may predict bone mass in CKD patients. From this preliminary analysis, we can conclude that the genetic factors may contribute more than diet to cardiovascular disease in CKD patients and we can speculate a role of GLP1R as genetic risk marker and SGCD as protective marker. The mechanisms hiding under these allelic variants influence the specific metabolic pathways associated with cardiovascular disease in CKD remain to be investigated. Further studies are needed to evaluate the impact of vitamin E and beta-carotene on CKD.

Introduzione. I pazienti con insufficienza renale cronica (IRC) sono ad alto rischio di mortalità cardiovascolare, superiore rispetto alla popolazione generale della stessa età. Infatti, la malattia cardiovascolare è la prima causa di morte nei pazienti affetti da IRC, a causa della presenza dei classici fattori di rischio insieme ai rischi specifici della patologia renale, come i disturbi del metabolismo minerale osseo. Le complicanze a lungo termine includono iperparatiroidismo e iperfosfatemia, legati ad un aumento del livello sierico di FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23). FGF23 è un fattore di crescita prodotto dal tessuto osseo che agisce sulla riduzione della fosfatemia. La letteratura riporta che una prolungata esposizione all'assunzione di fosfato aumenta la produzione di FGF23. I dati mostrano un legame tra FGF23 e iperfosfatemia, con il conseguente aumento del rischio cardiovascolare. Una restrizione dietetica del fosfato può essere una strategia contro la morbilità cardiovascolare e la formazione di calcificazioni vascolari. Un altro interessante marker del metabolismo osseo è la sclerostina, una proteina prodotta dagli osteociti ad attività inibitoria sull’osteogenesi e la sua produzione è aumentata nell’IRC. L'attuale studio si propone di indagare la mortalità e la morbilità cardiovascolare identificando marcatori genetici, biochimici e funzionali. Il progetto è uno studio osservazionale longitudinale e i pazienti reclutati sono stati seguiti per un follow-up di 5 anni. Sono stati studiati la predisposizione genetica al rischio di insorgenza di eventi cardiovascolari nell’IRC e i fattori nutrizionali e biochimici che potrebbero influenzare lo sviluppo e la progressione degli eventi cardiovascolari in questi pazienti. Popolazione e Metodi. L'attuale studio ha reclutato 332 pazienti affetti da IRC, sia in pre-dialisi che in emodialisi (HD) e ha raccolto i recall dietetici delle 24 ore, storia medica, parametri biochimici e strumentali e campioni di sangue per le analisi genetiche. La genotipizzazione degli SNPs è stata eseguita su 208 pazienti in HD utilizzando Illumina® MegaEX Array (SNP 2M) confrontando i pazienti con precedenti eventi cardiovascolari (CV1, 135 soggetti) con pazienti senza eventi cardiovascolari (CV0, 73 soggetti). Per ciascun marker è stato calcolato l'indice di fissazione (Fst) utilizzando CV1 e CV0 come sottopopolazioni al fine di identificare gli SNPs più differenziati tra i due sottogruppi. Utilizzando il cut-off del 99° percentile della distribuzione Fst, sono stati identificati 3218 SNPs come differenziati tra CV1 e CV0. Sono stati interrogati due strumenti di pathway funzionale (Panther and Ingenuity Pathway Analysis - IPA) per definire qualsiasi possibile ruolo biologico/patologico degli SNPs associati. Risultati. È stato osservato che i pazienti in HD hanno peso corporeo, calcemia e vitamina D inferiori e fosfatemia, PTH e FGF23 più elevati rispetto ai pazienti pre-dialisi con IRC allo stadio 3-5. Inoltre, la regressione lineare multipla mostra una relazione positiva tra fosfatemia, FGF23 e PTH in entrambi i pazienti HD e pre-dialisi, mentre è stata trovata una relazione negativa tra l'assunzione di fosfato e la fosfatemia. Probabilmente questo è dovuto all'effetto di FGF23. Il campione di soggetti è stato poi diviso in tre gruppi in base all'assunzione di fosfato. Per i pazienti in HD il livello sierico di FGF23 aumenta all’aumentare dell’assunzione di fosfato, mentre nei pazienti in pre-dialisi questa relazione non viene osservata. Inoltre, sono stati valutati i fattori di rischio legati alle malattie cardiovascolari. Un'analisi di regressione (Cox) sul campione ha dimostrato che un'assunzione elevata di fosfato nella dieta (>1200 mg/die) aumenta il rischio di eventi cardiovascolari. La sclerostina sierica, invece, è aumentata in 87 pazienti con IRC e il suo aumento era proporzionale al declino del tasso di filtrazione glomerulare (GFR). Considerando i terzili di sclerostina sierica, i pazienti nel terzile più alto hanno mostrato valori di GFR e di vitamina D inferiori e valori più elevati di FGF23 rispetto ai pazienti nel terzile più basso. Lo z-score osseo lombare (BMD) era maggiore nei pazienti nei terzili più alti e nel terzile medio, considerati insieme, rispetto ai pazienti nel terzile più basso. I pazienti che non assumevano calcitriolo come terapia cronica (n=60) avevano valori di GFR più alti e sclerostina sierica inferiore rispetto ai pazienti trattati cronicamente con calcitriolo. La regressione multipla ha mostrato che la sclerostina sierica era negativamente associata alla vitamina D e positivamente a FGF23 nell'intero campione e nei pazienti che non assumevano calcitriolo. Anche questa analisi ha mostrato che solo la sclerostina sierica era positivamente associata allo z-score della BMD in tutti i partecipanti e nei pazienti che non assumevano calcitriolo. Lo score di calcificazione dell'aorta e gli eventi cardiovascolari non erano associati alla sclerostina sierica. Per l'analisi genetica, sono stati uniti i risultati più significativi dei due strumenti di analisi e identificati due geni coinvolti in entrambi i pathway di malattia cardiovascolare (da IPA) e nello sviluppo del cuore (Panther): il recettore del peptide-1 simile al glucagone (GLP1R) e il delta Sarcoglicano (SGCD). Usando la tree regression analysis è stato scoperto che l'allele minore GLP1R rs10305445 è associato a percentuali più alte di CV1 (p=0.03) e, inversamente, l'allele minore SGCD rs145292439 è associato a percentuali più basse di CV1 (p=0.038) e livelli più elevati di HDL (p=0.015). La valutazione nutrizionale è stata condotta su 148 soggetti (98 in HD e 50 in pre-dialisi). Le analisi hanno mostrato una correlazione positiva tra lo stadio della malattia e l'assunzione di vitamina E, mentre aveva una correlazione negativa con l'assunzione di beta-carotene. Tuttavia, non sono state osservate correlazioni significative tra l'analisi dei dati nutrizionali raccolti e le analisi genetiche condotte. Conclusioni. I livelli sierici di FGF23 aumentano con un'elevata assunzione di fosfato nella dieta (> 1200 mg/die) nei pazienti in HD. I pazienti in HD hanno un più alto apporto di fosfato rispetto ai pazienti affetti da IRC allo stadio 3-5. I valori di FGF23 sono principalmente influenzati dall'assunzione di fosfato con il cibo nei pazienti in HD. In particolare, un'assunzione elevata di fosfati nella dieta (>1200 mg/die) aumenta il rischio di eventi cardiovascolari durante tutti gli stadi della IRC. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che la sclerostina sierica possa essere un determinante della sintesi di vitamina D e possa predire la massa ossea nei pazienti affetti da IRC. Da questa analisi preliminare, è possibile concludere che i fattori genetici possono contribuire più della dieta nello sviluppo di malattie cardiovascolari nei pazienti con IRC ed ipotizzare GLP1R come marcatore genetico di rischio e SGCD come marcatore protettivo per IRC. Rimangono da investigare i meccanismi che si nascondono sotto queste varianti alleliche e che influenzano le vie metaboliche specifiche associate alla malattia cardiovascolare nella IRC.