ROLE OF JAGGED IN MULTIPLE-MYELOMA-ASSOCIATED ANGIOGENESIS

Multiple myeloma (MM) is an incurable malignancy of plasma cells which accumulate within the bone marrow (BM). During progression from monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) to active MM, different modifications occur in plasma cells and BM microenvironment. Among the others, MM cells display Notch pathway dysregulation due to the up-regulation of two of its ligands, Jagged1 and Jagged2. Up-regulation of Jagged2 occurs during MGUS phase, while Jagged1 is upregulated overt MM. Jagged ligands may trigger Notch signaling in the nearby cells, therefore leading to the aberrant activation of Notch pathway within MM cells and also in the surrounding BM resident cells. Up to now, the outcome of this activation has been studied in the same tumor cells, osteoclasts and bone marrow stromal cells (BMSCs). Another key feature of MM progression is the increased levels an angiogenesis. Angiogenesis is a hallmark of different tumors and a crucial event for tumor growth and survival, moreover it represents a preferential way for metastasis formation. Previous evidences indicate that angiogenesis develops in accordance with MM progression. Indeed, endothelial cells (ECs) from MM patients display a different behavior if compared with ECs from MGUS patients or healthy ECs. Indeed, MMECs show increased capability to organize, migrate and express angiogenic factors. Angiogenesis is a complex event controlled by many soluble factors and signaling pathways. Among them vascular endothelial growth factor (VEGF) and Notch signaling play crucial roles in guiding new vessels formation and stabilization. Starting from these premises, this work aims to study the role of MM-derived Jagged1 and Jagged2 in modulating ECs behavior focusing on three events occurring during the angiogenic process. The events are EC adhesion to the extracellular matrix, migration and tube-organization. Three human multiple myeloma cells lines (HMCLs) have been used in which the expression of Jagged1 and Jagged2 has been knockdown with a subsequent Notch pathway downregulation. The effect of Jagged silencing has been studied under two different points of view. The modulation of the angiogenic potential of MM-derived soluble factors has been evaluated by stimulating ECs with conditioned media (CM) All performed assays show that Jagged silencing in MM cells decreases the CM ability to stimulate EC adhesion, motility and tube organization. We focused our attention to the molecular player released in the CM and found that MM-derived Jagged ligands are able to modulate MM-derived VEGF, a key angiogenic factor. We also assessed if MM-derived Jagged could activate the angiogenic Notch signaling in the adjacent ECs by direct cell-cell contact. We reasoned that direct interaction between MM cells and ECs could occur when new vessels reach MM cells, and specifically in the phase of vessel network organization, therefore we set V up co-culture system of ECs with HMCL and assessed the effect of Jagged silencing in MM cells. Results indicated that Jagged was essential for HMCLs to promote tube organization. To provide a definitive confirmation of the role of Jagged in this process as activator of Notch signaling in ECs through direct contact, tube formation assay was performed using a soluble form of Jagged1, thereby excluding the effect of angiogenic factor release from ECs. Our results indicated that the only stimulation with Jagged1 is sufficient to induce an angiogenic effect promoting EC tube organization. In the second part of this work, we explored the possibility that MM-derived Jagged could promote of the angiogenic potential of BMSCs, specifically in the stimulation of the three steps of angiogenesis analyzed before. Indeed, several evidences indicate that MM cells can shape the surrounding cell behavior, including BMSCs, potentiating their ability to enhance MM proliferation, survival and drug resistance. We focused our attention on BMSCs since these cells secrete many soluble pro-tumor factors, some of which are involved in angiogenesis, such as VEGF. To this aim, we set up a co-culture system of HS5, a BM stromal cell line, and HMCLs silenced or not for Jagged ligands and analyzed the angiogenic potential of the conditioned medium. Our results indicate that MM-derived Jagged trigger Notch pathway in BMSCs as well as the secretion of VEGF; on the contrary the effect was lost when Jagged1 and 2 were silenced in HMCLs. Consistently, the conditioned medium of BMSCs stimulated with MM cells increased adhesion, motility and tube organization in ECs, while angiogenesis was not supported if BMSCs were cultured with HMCL silenced for Jagged ligands. The angiogenic effect of MM-derived Jagged has also been confirmed exploiting an embryo zebrafish model of MM. This model allows a simpler and more replicable transplantation and results less expensive compared to a mouse model which requires longer time for development and results acquirement. The injection of MM-expressing Jagged stimulates sprouting angiogenesis from the sub-intestinal plexus while the absence of Jagged strongly impairs this effect. Finally, we tried to recapitulate the principal results obtained in vitro and in vivo to verify if the pro-angiogenic mechanism activate by MM-derived Jagged could be effective also in MM patients. Thereby, the last part of this work is focused on the evaluation of Jagged effect on tumor angiogenesis in human BM biopsies. To address this issue, three groups of patients were identified according to their MM infiltration grade: Low grade for infiltration lower than 20%; medium grade for infiltration from 21% to 50%; High grade for infiltration higher than 51%. Immunohistochemical analyses showed that Jagged1 and HES6 increased in parallel with MM cell infiltration grade, VEGF expression and the amount of new vessels (CD34+ cells). These results are consistent with previous in vitro and in vivo evidences indicating that Jagged ligands play an angiogenic role by stimulating VI the angiogenic potential of both MM cells and BMSCs. In addition, the analysis on BM biopsies further suggests that angiogenic effect is restricted to one of the two ligands, Jagged1, since Jagged2 is expressed at high levels in all BM biopsies at all the infiltration grades and does not show correlation with VEGF expression or new vessel formation. In conclusion, this study shows the central role of Notch pathway activation in myelomatous BM to activate tumor angiogenesis mediated by the up-regulation of Jagged in MM cells and suggests that a main role is played by Jagged1. These results further support the key role of MM-derived Jagged ligands in the pathological communication through which MM cells may reprogram the surrounding microenvironment to further promote tumor progression. Specifically, this work adds angiogenesis to other effects previously reported, including MM cell growth, bone destruction, intrinsic and BMSC-induced drug resistance, and thereby contributes to provide further evidence for the use of Jagged ligands as promising therapeutic targets in the treatment of MM patients.

Il mieloma multiplo è una neoplasia delle plasma cellule ancora incubabile, caratterizzata dall’accumulo di cellule tumorali nel midollo osseo. Durante la progressione dalla fase di Gammopatia monoclonale a significato incerto (MGUS) a mieloma multiplo diverse modifiche avvengono sia nelle plasma cellule sia nel microambiente del midollo osseo. È stato infatti dimostrato che le cellule di mieloma presentano la deregolazione della via di segnalazione di Notch causata dall’aumento dell’espressione dei ligandi Jagged1 e Jagged2. L’aumentata espressione di Jagged2 si riscontra anche durante la fase di MGUS, invece, Jagged1 risulta iper-espresso solo nella fase di mieloma multiplo. I ligandi Jagged possono attivare la via di segnalazione di Notch nelle cellule vicine, inducendo quindi un’attivazione di Notch non solo tra le stesse cellule di mieloma ma anche nelle cellule del microambiente midollare quali osteoclasti e cellule stromali. Un’altra importante caratteristica della progressione del mieloma multiplo è l’aumento dell’angiogenesi nel midollo. L’ angiogenesi è una caratteristica comune e peculiare di molti tumori poiché è fondamentale per la sopravvivenza e la crescita del tumore ed inoltre è sfruttato come via preferenziale per la formazione di metastasi. Diverse evidenze indicano che l’angiogenesi si sviluppa di pari passo con la progressione del mieloma multiplo. Infatti, le cellule endoteliali di pazienti affetti da mieloma mostrano un differente fenotipo rispetto a quelle derivanti da pazienti affetti da MGUS o rispetto a cellule sane. L’endotelio derivante da soggetti con mieloma multiplo ha un’aumentata capacità migratoria e organizzativa in saggi condotti in vitro ed inoltre esprime in misura maggiore fattori angiogenici. L’angiogenesi è un evento complesso controllato da diversi fattori solubili e da diverse vie di segnalazione. Tra questi il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF) e la via di segnalazione di Notch svolgono un ruolo fondamentale nella formazione e nell’organizzazione dei vasi di nuova formazione. Da queste premesse iniziali si sviluppa questo lavoro che mira a studiare il ruolo dei ligandi Jagged1 e Jagged2 nella stimolazione dell’angiogenesi associata al mieloma multiplo. Sono stati considerati tre eventi associati alla progressione dell’angiogenesi che sono: l’adesione delle cellule endoteliali ad una matrice extracellulare, la migrazione e l’organizzazione di strutture simil-tubulari. Per questo studio sono state utilizzate tre linee cellulari umane di mieloma multiplo nelle quali l’espressione dei ligandi Jagged1 e 2 è stata silenziata con il conseguente decremento dell’attivazione della via di segnalazione di Notch. L’effetto del silenziamento dei ligandi Jagged è stato studiato da due diversi punti di vista. È stata valutata la modulazione del potenziale angiogenico dei fattori solubili rilasciati dal mieloma multiplo usando il medium condizionato delle cellule di mieloma. Tutti i saggi effettuati mostrano che il silenziamento dei Jagged nelle cellule di mieloma causa un decremento del potenziale angiogenico dei medium condizionati. Inoltre, abbiamo valutato la presenza e l’eventuale modulazione di VEGF ed abbiamo dimostrato che i ligandi Jagged e quindi la via di segnalazione di Notch, è in grado, nelle cellule di mieloma, di regolare la produzione di VEGF che è uno dei principali fattori che regolano il proce II Inoltre, abbiamo valutato l’eventuale attivazione di Notch nelle cellule endoteliali mediate contatto diretto con le cellule di mieloma esprimenti o meno i ligandi Jagged. Presumendo che il contatto diretto tra cellula di mieloma e cellula endoteliale avvenga nel momento in cui i vasi neoformati raggiungono la massa tumorale e che questo influisca sull’organizzazione vascolare, abbiamo sviluppato un saggio di co-coltura tra cellule di mieloma e cellule endoteliali per valutare l’effetto dei ligandi Jagged nella modulazione dell’organizzazione endoteliale. I risultati ottenuti indicano che i ligandi Jagged hanno un ruolo essenziale nel promuovere l’organizzazione dell’endotelio. Per avere ulteriore conferma di questo effetto, lo stesso saggio è stato condotto sfruttando una forma solubile di Jagged1. In tal modo abbiamo potuto escludere l’influenza derivante dai fattori solubili rilasciati dalle cellule di mieloma e il dato così ottenuto conferma il ruolo centrale di Jagged1 nella stimolazione diretta dell’endotelio di cui promuove l’organizzazione. Nella seconda parte del lavoro, abbiamo valutato se l’interazione tra mieloma e cellula stromale fosse in grado di aumentare il potenziale angiogenico dello stroma. Infatti, diverse evidenze indicano che le cellule di mieloma hanno la capacità d modellare il comportamento delle cellule circostanti incluse le cellule stromali di midollo, aumentando la loro capacità di sostenere il tumore promuovendone la crescita, la sopravvivenza e inducendo lo sviluppo di meccanismi di resistenza farmacologica. Abbiamo deciso di studiare in particolare le cellule stromali poichè esse sono tra le maggiori produttrici di fattori solubili pro-tumorali alcuni dei quali coinvolti nella progressione dell’angiogenesi come il VEGF. Per questo scopo è stato sfruttato un sistema di co-cultura tra la linea cellulare umana di stroma midollare, HS5, e le 3 linee cellulari mieloma silenziate o meno per i ligandi Jagged. Il potenziale angiogenico dei medium condizionati delle co-culture, confrontato con quello derivante dalla coltura singola di cellule stromali, è stato valutato nei tre saggi di adesione, motilità e organizzazione endoteliale. I nostri risultati confermano che I ligandi Jagged del mieloma attivano nello stroma la via di segnalazione di Notch e stimolano una maggiore produzione di VEGF sia rispetto alla coltura singola che rispetto alla cocultura in assenza dei Jagged. Il medium condizionato derivante dalla co-cultura in presenza di un’attiva segnalazione di Notch induce un aumento nell’adesione, nella motilità e nell’organizzazione dell’endotelio, caratteristiche che si riducono notevolmente nella stimolazione con medium condizionato derivante da co-culture in assenza dei jagged. L’effetto pro-angiogenico dei ligandi Jagged è ulteriormente stato confermato utilizzando un modello embrionale di Zebrafish. Questo modello ha il vantaggio di essere di facile manipolazione e permette di ottenere una elevata riproducibilità; inoltre, risulta essere meno oneroso rispetto ad un modello murino che comporta tempi di sperimentazione più lunghi. Nel nostro modello di Zebrafish, l’iniezione di cellule di III mieloma esprimenti i ligandi stimola la formazione di numerose ramificazioni vascolari dal plesso di vasi intestinali preesistenti. Al contrario, l’assenza dei Jagged nel mieloma riduce notevolmente questo effetto. Infine, abbiamo cercato di ricapitolare i risultati ottenuti in vitro ed in vivo per verificare se il meccanismo pro-angiogenico attivato dai ligandi Jagged potesse essere efficace anche nei pazienti affetti da mieloma multiplo. L’ultima parte del presente lavoro si concentra sulla valutazione dell’effetto dei Jagged nell’angiogenesi tumorale in biopsie umane di midollo osseo. Sono stati identificati 3 gruppi di pazienti con mieloma multiplo in base al loro grado di infiltrazione: i pazienti con infiltrazione di cellule di mieloma minore del 20% sono stati classificati come basso grado; con infiltrazione dal 21% al 50% come grado medio e con infiltrazione superiore al 51% come grado alto. Le analisi immunoistochimiche hanno mostrato che Jagged1 ed HES6 aumentano parallelamente al grado di infiltrazione delle cellule di mieloma, all’espressione di VEGF e alla quantità di nuovi vasi (cellule positive al marcatore CD34). Questi risultati sono coerenti con le precedenti evidenze ottenute sia in vitro che in vivo che indicano che i ligandi Jagged svolgono un ruolo pro-angiogenico. Inoltre, le analisi sulle biopsie di midollo sembrano suggerire che l’effetto angiogenico è limitato ad uno dei due ligandi, in particolare Jagged1, poiché Jagged2 presenta alti livelli di espressione in tutti i gradi di infiltrazione e non mostra alcuna correlazione con l’espressione di VEGF e con la presenza di vasi. In conclusione, questo studio mostra il ruolo centrale della via di segnalazione di Notch nell’attivazione dell’angiogenesi tumorale mediata dalla iper-espressione dei ligandi Jagged espressi dal mieloma e suggerisce che il ruolo principale è svolto da Jagged1. Ciò conferma ulteriormente il ruolo chiave dei ligandi Jagged espressi dalla cellula di mieloma nel riprogrammare il microambiente circostante per promuovere la progressione del tumore stesso. In particolare, questo lavoro attribuisce ai ligandi Jagged un ruolo anche nella stimolazione dell’angiogenesi, che si aggiunge ad altri effetti tra cui il supporto alla crescita tumorale, l’induzione delle lesioni ossee e lo sviluppo di resistenza a trattamenti farmacologici contribuendo così a fornire un razionale per l'uso di ligandi Jagged come bersagli terapeutici promettenti nel trattamento di pazienti con mieloma multiplo.