REGULATING HYDROLASES OF THE ENDOCANNABINOID SYSTEM: NOVEL PHOTOMETRIC ASSAYS FOR DRUG DISCOVERY

The thesis revolves around the investigation of the possibilities of developing novel high-throughput screening (HTS) enzyme assays dedicated to regulating esterases of the endocannabinoid system (ES). The ES is responsible for maintaining the homeostatic balance in the organism, regulating and modulating a wide array of physiological responses to improve general well-being. It is made up of the cannabinoid receptors (CB), endocannabinoids (EC) and their catabolic enzymes. A dysregulation of ES is connected to pathological conditions such as pain, inflammation, anxiety, and other disorders. The regulating enzymes include the amidase FAAH, and the esterases MAGL, ABHD6 and ABHD12. Pharmacological blockade of these enzymes has emerged as a potentially attractive strategy to augment EC signalling and retain the beneficial effects of CB activation, while avoiding the undesirable side effects observed with direct stimulation of the receptors. Also, the blockade of these enzymes results in cell death for various cancer types overexpressing them. Conventional assays for hydrolase activity and inhibitor screening utilise radiolabeled substrates (expensive and laborious), p-nitrophenyl alkyl esters which liberate the chromogenic substrate p-nitrophenol, or, more recently, probes which hydrolysis produces fluorescent molecules. These fluorescent molecules greatly enhance the performances of the methods employing them, especially in terms of sensitivity. Among the methods following this approach, we can count a work published by our group using 7-hydroxyresorufinyl arachidonate as a fluorogenic substrate for MAGL. On the other hand, the study of the properties of the integral membrane esterases ABHD6 and ABHD12 lies at an earlier stage, since we still lack the availability of the isolated, active enzymes allowing for a precise characterisation of their biochemical properties; furthermore, the only assay available for the study of their activities relies on a four-step enzymatic reaction which includes an aspecific analyte as glycerol among its substrates, and uses whole cell lysates as the enzyme source. Experimental approaches We synthesized and evaluated a total of ten new molecules, eight of which turned out to be substrates for MAGL; we then found their kinetic constants in order to appraise them. The most promising of these molecules, 7-Hydroxyresorufin octanoate, was validated with known inhibitors to be proposed as an all-round better MAGL HTS substrate. This molecule is more easily synthesized and more stable than those employed until now, and has better kinetic properties. Taking advantage of the wide array of experimental data available, computational docking studies were performed to explore structural-activity explanations of the different hydrolytic behaviors which were observed. A novel approach to the quantification of MAGL activity is the use of bioluminescence, a technique which offers a sensitivity of ten to a thousand times that of fluorescence assays. We tested the viability of a novel chimeric luciferase to work as a reporter in the assay conditions, since significant DMSO concentrations, which are needed for the complete solubilisation of lipophyilic substrates, totally inhibit wild-type luciferase. Our luciferase, PLG2, instead showed a decreased, yet fully viable activity. PLG2 is a chimeric enzyme, developed by the laboratories of prof. Bruce Branchini at Connecticut College (New London, CT, USA), where the candidate has spent a research period. The plasmid with PLG2 cDNA was then expressed at our laboratories in Milan as well. The assay was fully developed and validated, and its potential as a HTS method was discussed. Finally, we layed down preliminary data for an expression protocol of the integral membrane hydrolases ABHD6 and ABHD12 in their active form, using an E. coli strain as host. Recombinant expression of proteins in bacterial cultures has the advantage of providing relatively large quantities of pure protein, but mammalian membrane enzymes are often incorporated into inclusion bodies by bacteria, thus completely losing their activity. Nonetheless, our expression protocol, while being still at an unoptimised stage, has shown the capability of producing both of these proteins, while retaining at least part of their activity. This approach still needs more work to be completed, but the data gathered during the work reveal that this is an interesting way to obtain substantial amount of the ES ABHD hydrolases. A substantial amount of these proteins in a pure, active form would allow for their complete characterisation from a biochemical, pharmacological, and structural point of view.

Le ricerche oggetto della tesi hanno riguardato le possibilità di sviluppare nuovi saggi enzimatici di screening ad alto rendimento (HTS) dedicati alle idrolasi regolatrici del sistema endocannabinoide (ES). Il ruoli dell’ES è quello di mantenere il bilanciamento omeostatico dell’organismo, cui giunge regolando e modulando un ampio spettro di risposte fisiologiche, dando come risultato ultimo uno stato di benessere generale. L’ES è costituito dai recettori cannabinoidi (CB), dagli endocannabinoidi (EC) e dagli enzimi regolatori di questi ultimi. Una disregolazione dell’ES è stata messa in relazione a condizioni patologiche, quali dolore cronico, stati infiammatori, ansia e vari altri disordini. Gli enzimi regolatori includono l’amidasi FAAH e le esterasi MAGL, ABHD6 ed ABHD12. L’inibizione farmacologica di questi enzimi è emersa quale strategia promettente per aumentare il signaling da EC e mantenere gli effetti benefici dell’attivazione dei CB, evitando gli effetti indesiderati dovuti all’attivazione recettoriale farmacologica diretta. Inoltre, l’inibizione di questi enzimi porta alla morte cellulare di diversi tipi di cancro che li sovraesprimono. I saggi convenzionali per l’attività delle idrolasi e lo screening dei loro inibitori utilizzano substrati marcati con radionuclidi (costosi e di difficile impiego), di esteri alchilici dei p-nitrofenili che liberano il substrato cromogenico p-nitrofenolo o, più recentemente, di substrati che rilasciano molecole fluorescenti dopo essere stati idrolizzati. Queste molecole fluorescenti aumentano di molto le rese dei metodi che le utilizzano, specialmente sotto il profilo della sensibilità. Uno di questi metodi, basato sul substrato fluorigenico per MAGL 7-idrossiresorufinil arachidonato, è stato recentemente pubblicato dal nostro gruppo. Su un altro fronte, lo studio delle proprietà delle esterasi transmembrana ABHD6 ed ABHD12 si trova ai primi stadi, perché non si ha ancora la disponibilità dei due enzimi in forma attiva ed isolata, che permetterebbe una precisa caratterizzazione delle loro proprietà biochimiche; inoltre, il solo saggio disponibile per lo studio della loro attività si basa su una reazione enzimatica costituita da quattro passaggi, che include un analita aspecifico come il glicerolo ed utilizza lisati cellulari interi come fonte degli enzimi. Approcci sperimentali Nella prima parte del lavoro di tesi abbiamo sintetizzato dieci derivati della resorufina caratterizzati da catene laterali sature, insature, ramificare, aromatiche ed abbiamo studiato un loro possibile impiego come substrati migliori per MAGL studiandone le loro costanti cinetiche. La più promettente di queste molecole, il 7-Idrossiresorufinil ottanoato, è stata validata tramite degli inibitori noti dell’enzima e proposta come il miglior substrato in generale per saggi HTS su MAGL. Questa molecola risulta essere più facilmente sintetizzabile e più stabile di quelle fino ad ora utilizzate, oltre a possedere migliori proprietà cinetiche. Sfruttando i dati sperimentali derivanti da questo studio, abbiamo poi condotto dei test computazionali di docking per trovare delle spiegazioni ai diversi comportamenti idrolitici osservati basate sulle interazioni strutturali fra i vari substrati e l’enzima. Un nuovo approccio alla quantificazione dell’attività di MAGL che abbiamo sperimentato è l’uso della bioluminescenza, una tecnica che offre una sensibilità da dieci a mille volte superiore a quella dei saggi in fluorescenza. Abbiamo studiato la possibilità che una nuova luciferasi chimerica possa essere attiva nelle condizioni del saggio, poiché concentrazioni significative di DMSO, indispensabile per la solubilizzazione del substrato, inibiscono completamente le luciferasi di lucciola wild-type. Questo problema è stato risolto impiegando la luciferasi PLG2, un enzima chimerico ottenuto presso i laboratori del prof. Bruce Branchini del Connecticut College (New London, CT, USA), presso cui il candidato ha trascorso un periodo di studio e ricerca. Il plasmide col cDNA della proteina è stato quindi espresso anche presso i laboratori di Milano. Il saggio è stato completamente sviluppato e validato ed il suo potenziale come metodo HTS è stato discusso. Infine, abbiamo ottenuto dati preliminari per giungere ad un protocollo di espressione ricombinante delle idrolasi transmembrana ABHD6 ed ABHD12 in forma attiva, utilizzando un ceppo di Escherichia coli come ospite. L’espressione ricombinante di proteine nelle colture batteriche ha il vantaggio di fornire quantità relativamente abbondanti di proteina pura, ma gli enzimi transmembrana dei mammiferi vengono spesso immagazzinati dai batteri all’interno di corpi di inclusione, perdendo quindi del tutto o quasi la propria attività. Ciò nonostante, il nostro protocollo di espressione, benché si trovi ancora ad uno stadio non ottimizzato, ha mostrato la capacità di produrre entrambe queste proteine, conservando almeno in parte la loro attività. Questo approccio necessita di ulteriore lavoro per essere completato, ma i dati raccolti durante il progetto mostrano che si tratta di un modo interessante per ottenere quantitativi considerevoli delle idrolasi ABHD facenti parte dell’ES. La disponibilità delle proteine, attive ed in forma pura, in quantitativi sufficienti, consentirebbe la caratterizzazione completa degli enzimi da un punto di vista biochimico, farmacologico e strutturale.