Plant lateral organs: development, growth and ufe span

ABSTRACT Plants can be consider fundamental for maintaining human well-being, since they provide several benefits that humans freely gain from the natural environment and from properly functioning ecosystems (Whelan et al., 2005). By 2050, the world population will have reached more or less 9 billion people, therefore, the demands for energy-intensive food, shelter, clothes, fibre, and renewable energy will dramatically increase (Grierson et al., 2011). To satisfy such increasing goods demand it requires a strong interdisciplinary collaboration between plant scientists, working to improve crop, and environmental scientists, working on environmental stability to translate the specific knowledge into field-based solutions. In this contest, plant developmental biology has an important role because it allow the identification and manipulation of useful and interesting traits which then can be used for breading programs to select new crop cultivars that need less inputs and are adapted to live in their environment. So they can help to overcome the problems of current agronomic practice like loss of biodiversity, soil degradation, chemical pollution and depletion of water resources (Khush, 2001). Particularly, fruit represent the most valuable part of crop production. Actually, they are the edible part of many crops, including those used as dessert fruits (apples, strawberries, grapes), as vegetables (cucumbers, beans, tomatoes), as sources of culinary oils (olive, oil palm), or for other culinary products (vanilla). Fruits are also important for seed production (canola, cereals) and several non-edible substances (cotton, industrial oils), and can be adapted to the production of many other products, including pharmaceuticals. From a botanical point of view, fruit is the result of the development of ovary after pollination and fertilization and it represent a major evolutionary innovation of Angiosperms (Ferrandiz, 2011). Actually, fruits are essential for plant reproduction and adaptation, and greatly enhance the efficiency of seed dispersal. The ability of the seeds to germinate and grow far away from the parent plant allows Angiosperms to colonize new areas, reducing the risk of inbreeding and sibling competition. The present work can be divided in two different research lines. The first one (first and second chapters) concerns the regulation of plant architecture and meristem activity in the model organisms Antirrhinum majus and Arabidopsis thaliana. The second one (third and fourth chapters) represents the main project of this PhD thesis and it aims to identify a powerful tool for the elucidation of the molecular mechanisms controlling fruit formation in Arabidopsis thaliana. Focusing on the second research line, to explore the mechanisms controlling fruit formation and maturation, we performed a transcriptomic analysis on the valve tissue of the Arabidopsis thaliana silique, using the RNAseq strategy. In doing so, we have generated a dataset of differentially regulated genes that will help to elucidate the molecular mechanisms that underpin the initial phase of fruit growth, and subsequently trigger fruit maturation. The robustness of our dataset has been tested by functional genomic studies. Using a reverse genetics approach, we selected 10 differentially expressed genes and explored the consequences of their disruption for both silique growth and senescence. We found that genes contained in our dataset (encoding for transcription factors, cytoskeletal proteins, and enzymes that modulate hormone homeostasis) play essential roles in different stages of silique development and maturation. Moreover, from our dataset, among down-regulated genes, we found the AUXIN RESPONSE FACTOR 8 (ARF8) gene, whose transcript diminishes steadily from the first time-point to the last. ARF8 encodes for a transcription factor that can act specifically in the pistil, in response to auxin signal. The plant hormone auxin regulates the major aspects of plant development mainly through its differential distribution within plant tissues. Particularly, ARF8 seems to be the link between hormone and molecular mechanism in fruit initiation (Goetz et al., 2006). In Arabidopsis, fruit initiation is generally repressed until fertilization occurs. However, in the already characterized auxin response factor 8-4 (arf8-4) mutant, it seems that fruit initiation is uncoupled from fertilization, resulting in the formation of seedless fruit (parthenocarpic fruit), if fertilization is prevented before anthesis with the removal of anthers (Goetz et al., 2006). The structure that develops from arf8-4 unfertilized pistil, has been considered for years a parthenocarpic silique because it is longer than wild-type unfertilized pistil and it shows a dehiscence pattern. However, in 2010 Carbonell-Bejerano and collaborators reported that there is a developmental senescence program (that includes the development of the dehiscence zone) which is independent form fertilization and so it is in common between seeded and unfertilized Arabidopsis pistils. In line with this study, our findings suggest that arf8-4 mutant has not a real parthenocarpic phenotype but rather it shows a mis-regulation in the hormones crosstalk, likely due to a truncated protein. This alteration can affect the coordination between growth and senescence of the pistil, modifying the correct progression of the developmental processes. For this reason, at least in Arabidopsis, the only structural characteristic that differentiates arf8-4 parthenocarpic fruit from wild-type unfertilized pistil is the increased size. Further analyses will be necessary to continue investigating arf8-4 phenotype, including high-throughput molecular analyses (mass-spectrometry) about hormones content in the valve tissue and western-blot analysis to confirm definitely the presence of the truncated protein in arf8-4 plants. Overall, the main outcome of this work was that the transcriptome-based gene list on the valve tissue of the Arabidopsis thaliana silique represents a powerful tool for the elucidation of the molecular mechanisms controlling fruit formation. References Carbonell-Bejerano, P., Urbez, C., Carbonell, J., Granell, A. and Perez-Amador, M.A. (2010) A Fertilization-Independent Developmental Program Triggers Partial Fruit Development and Senescence Processes in Pistils of Arabidopsis. Plant Physiol., 154, 163–172. Ferrandiz, C. (2011) Fruit Structure and Diversity. Encycl. Life Sci. Goetz, M., Vivian-Smith, A., Johnson, S.D. and Koltunow, A.M. (2006) AUXIN RESPONSE FACTOR8 Is a Negative Regulator of Fruit Initiation in Arabidopsis. Plant Cell, 18, 1873–1886. Grierson, C.S., Barnes, S.R., Chase, M.W., et al. (2011) One hundred important questions facing plant science research. New Phytol., 192, 6–12. Khush, G.S. (2001) Green revolution: the way forward. Nat. Rev. Genet., 2, 815–822. Whelan, C.J., Wenny, D.G. and Marquis, R.J. (2005) Ecosystems and Human Well-being: Synthesis. Isl. Press. Washington, DC, 1–137.

RIASSUNTO Le piante sono fondamentali per il mantenimento del benessere dell’umanità, in quanto forniscono numerosi servizi indispensabili per il mantenimento di un ecosistema correttamente funzionante (Whelan et al., 2005). Entro il 2050, la popolazione mondiale avrà raggiunto più o meno 9 miliardi di persone, quindi le richieste di cibo, di materie prime e di energia rinnovabile aumenteranno drasticamente (Grierson et al., 2011). Per soddisfare questa crescente domanda di beni, è necessaria una forte collaborazione interdisciplinare tra gli scienziati che lavorano per migliorare le colture e gli scienziati che si occupano dell’ambiente, in modo da tradurre specifiche conoscenze di laboratorio in soluzioni pratiche sul campo. In questo contesto, la biologia vegetale svolge un ruolo importante perché consente l'identificazione e la manipolazione di caratteri utili e interessanti che possono essere utilizzati nei programmi di breeding per selezionare nuove linee di colture con caratteristiche desiderabili come una minor necessità di input lasciando invariata la resa, e una maggior adattabilità all’ambiente. Solo lavorando in questa direzione sarà possibile arginare i problemi dell'attuale pratica agronomica come la perdita di biodiversità, il degrado del suolo, l'inquinamento chimico e l'esaurimento delle risorse idriche (Khush, 2001). In particolare, i frutti rappresentano la parte più preziosa della produzione agricola. Infatti rappresentano la parte commestibile di molte colture, comprese quelle utilizzate come frutta da dessert (mele, fragole, uva), come verdure (cetrioli, fagioli, pomodori), come fonti di oli culinari (oliva, olio di palma) o per altri prodotti culinari (vaniglia). I frutti sono importanti anche per la produzione di semi (colza, cereali) e diverse sostanze non commestibili (cotone, oli industriali) e possono essere sfruttati per la produzione di molti altri prodotti, compresi quelli farmaceutici. Da un punto di vista botanico, il frutto è il risultato dello sviluppo dell'ovario dopo l'impollinazione e la fecondazione. Questa struttura rappresenta inoltre una delle principali innovazioni evolutive di Angiosperme (Ferrandiz, 2011). Infatti, i frutti sono essenziali per la riproduzione e l'adattamento delle piante e migliorano notevolmente l'efficienza della dispersione dei semi. La capacità dei semi di germogliare e crescere lontano dalla pianta madre ha consentito alle Angiosperme di colonizzare nuove aree, riducendo il rischio di inbreeding e competizione tra sibling. Il presente lavoro può essere diviso in due diverse linee di ricerca. La prima (primo e secondo capitolo) riguarda la regolazione dell'architettura delle piante e dell'attività dei meristemi negli organismi modello Antirrhinum majus e Arabidopsis thaliana. La seconda invece (terzo e quarto capitolo) rappresenta il progetto principale di questa tesi di dottorato e mira a identificare un solido strumento per la delucidazione dei meccanismi molecolari che controllano la formazione dei frutti in Arabidopsis thaliana. Concentrandosi sulla seconda linea di ricerca, per esplorare i meccanismi che controllano la formazione e la maturazione dei frutti, abbiamo eseguito un'analisi trascrittomica sul tessuto delle valve della siliqua di Arabidopsis thaliana, utilizzando la strategia RNAseq. In tal modo, abbiamo generato un set di dati di geni differenzialmente regolati che aiuteranno a chiarire i meccanismi molecolari che sono alla base della fase iniziale della crescita del frutto, e successivamente della fase di maturazione. La robustezza del nostro set di dati è stata testata atraverso studi di genomica funzionale. Utilizzando un approccio di genetica inversa, abbiamo selezionato 10 geni differenzialmente espressi ed esplorato le conseguenze della loro distruzione sulla crescita e la senescenza delle silique. Abbiamo scoperto che i geni contenuti nel nostro set di dati (codificanti per fattori di trascrizione, proteine del citoscheletro ed enzimi che modulano l'omeostasi degli ormoni) svolgono ruoli essenziali in diversi stadi dello sviluppo e della maturazione della siliqua. Inoltre, dal nostro set di dati, tra i geni down-regolati, abbiamo trovato il gene AUXIN RESPONSE FACTOR 8 (ARF8), il cui trascritto diminuisce costantemente dal primo all'ultimo stadio di sviluppo della siliqua. ARF8 codifica per un fattore di trascrizione che può agire specificamente nel pistillo, in risposta al segnale dell’auxina. L'ormone vegetale auxina regola i principali aspetti dello sviluppo della pianta principalmente attraverso la sua distribuzione differenziale all'interno dei tessuti vegetali. In particolare, ARF8 sembra essere il legame tra il segnale ormonale e il meccanismo molecolare di formazione del frutto (Goetz et al., 2006). In Arabidopsis, la formazione del frutto viene generalmente repressa fino a quando avviene la fecondazione. Tuttavia, nel mutante auxin response factor 8-4 (arf8-4), già precedentemente caratterizzato, sembra che la formazione del frutto sia disgiunta dalla fecondazione, risultando nella formazione di un frutto privo di semi (partenocarpico; Goetz et al., 2006). La struttura che si sviluppa dal pistillo non fecondato del mutante arf8-4, è stata considerata per anni una silique partenocarpica in quanto risulta più lunga del pistillo non fecondato wild-type e presenta un pattern di deiscenza, processo essenziale per l’apertura del frutto maturo e il rilascio dei semi. Nonostante ciò, nel 2010, Carbonell-Bejerano e collaboratori hanno riferito che esiste un processo di senescenza inerente allo sviluppo che include lo sviluppo della zona di deiscenza e che risulta essere indipendente alla fecondazione. Questo processo di senescenza quindi è comune tra pistilli fecondati e non fecondati. In linea con questo studio, i nostri risultati suggeriscono che il mutante arf8-4 non presenta un vero fenotipo partenocarpico ma piuttosto mostra un’alterazione nella regolazione del cross-talk ormonale, probabilmente dovuta a una proteina tronca. Questa alterazione può a sua volta influenzare il coordinamento tra crescita e senescenza del pistillo, modificando quindi la corretta progressione dei processi di sviluppo. Per questo motivo, almeno in Arabidopsis, l'unica caratteristica strutturale che differenzia il frutto parthenocarpic di arf8-4 dal pistillo non fecondato di tipo wild-type è la dimensione aumentata. Ulteriori analisi saranno necessarie per continuare a studiare il fenotipo di arf8-4, incluse analisi molecolari ad alto rendimento (spettrometria di massa) sul contenuto di ormoni nel tessuto delle valve e analisi western-blot per confermare definitivamente la presenza della proteina tronca nelle piante mutanti arf8-4. Referenze Carbonell-Bejerano, P., Urbez, C., Carbonell, J., Granell, A. and Perez-Amador, M.A. (2010) A Fertilization-Independent Developmental Program Triggers Partial Fruit Development and Senescence Processes in Pistils of Arabidopsis. Plant Physiol., 154, 163–172. Ferrandiz, C. (2011) Fruit Structure and Diversity. Encycl. Life Sci. Goetz, M., Vivian-Smith, A., Johnson, S.D. and Koltunow, A.M. (2006) AUXIN RESPONSE FACTOR8 Is a Negative Regulator of Fruit Initiation in Arabidopsis. Plant Cell, 18, 1873–1886. Grierson, C.S., Barnes, S.R., Chase, M.W., et al. (2011) One hundred important questions facing plant science research. New Phytol., 192, 6–12. Khush, G.S. (2001) Green revolution: the way forward. Nat. Rev. Genet., 2, 815–822. Whelan, C.J., Wenny, D.G. and Marquis, R.J. (2005) Ecosystems and Human Well-being: Synthesis. Isl. Press. Washington, DC, 1–137.