The efficiency of in vitro embryo production (IVP) technologies is still limited in both livestock and humans. IVP consists of 4 major steps in which the key events of the development of a new organism occur in the laboratory: 1) the recovery of immature (prophase I arrested) oocytes from live donors or from isolated ovaries collected from dead animals; 2) the in vitro maturation (IVM), i.e. the culture of oocytes up to the metaphase II stage of meiosis; 3) the in vitro fertilization (IVF) and 4) the in vitro embryo culture (IVC), during which the newly formed embryos reach the blastocyst stage of development. After IVC, the embryos can be transferred to female recipients through embryo transfer or be frozen for later use. Despite the potential advances offered by IVP systems, the percentage of success in cow remained stunning stable over the last 30 years and is restricted to one third of the oocytes isolated from the ovary reaching the blastocyst stage of embryonic development. This limitation is similar in other species. The quality of the oocytes is crucial for IVP efficiency and the maturation of the oocyte represents the first key limiting step of the system. At the time of removal from the ovarian antral follicles, the oocytes are arrested at the prophase of the first meiotic division, the so called Germinal Vesicle (GV) stage, in which the chromatin is enclosed within the nuclear envelope. GV stage oocytes routinely used in IVP settings are collected from middle sized antral follicles and, as such, would still need to complete the final growth and differentiation steps, necessary to provide the so-called ‘developmental competence’, i.e. the machinery required to sustain fertilization and embryo development. Moreover, since mammalian follicle development occurs in waves, some of the limiting factors lie in the intrinsic heterogeneity of the oocytes that are subjected to IVM and in the lack of dedicated in vitro approaches to finalize their differentiation process. Studies conducted during the doctorate program aimed at defining morphological and functional non-invasive parameters that can be used as marker of oocyte differentiation and that can be considered to improve the efficiency of current techniques. The studies were conducted in porcine and bovine animal models. In both species, the progressive changes in large-scale chromatin configuration, that characterize the oocyte differentiation process, were used as a marker of differentiation and developmental potential acquisition. In particular, the main assumption was to utilize the chromatin configuration as an indicator of the heterogeneity of the oocyte population subjected to IVM and design customized IVM protocols with increased efficiency and efficacy, that would allow to maximize the exploitation of the oocyte reservoir. In the first part, the porcine oocyte GV chromatin configuration patterns were characterized, and this information was utilized for testing a pre-IVM protocol able to improve oocyte developmental competence. In the second part, the cumulus cells transcriptomic profiles based on the GV chromatin configuration as a marker of oocyte developmental competence were studied in the bovine model. In these studies, the combined use of morphological parameters together with the analysis of the transcriptomic profiles of cumulus cells allowed us to validate a basic oocyte culture protocol. In conclusion, our data indicate that the improvement of IVP outcome requires the selection of a more homogeneous oocyte population that must be treated considering specific oocyte cultural needs, so designing customized pre-IVM culture system. In particular, our findings contribute to the identification of specific non-invasive biomarker(s) of oocyte health status and final differentiation that can provide useful tools for the selection of good quality oocyte and to improve the reproductive potential in animal breeding.

L'efficienza delle tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) è ancora limitata sia in ambito zootecnico che in clinica umana. L'IVP consiste in 4 fasi principali in cui si verificano in laboratorio gli eventi chiave dello sviluppo di un nuovo organismo: 1) il recupero di ovociti immaturi (arrestati in profase I della divisione meiotica) da donatrici vive o isolati da ovaie raccolte da animali macellati; 2) la maturazione in vitro (IVM), cioè la coltura degli ovociti fino allo stadio di metafase II della meiosi; 3) la fecondazione in vitro (IVF) e 4) la coltura in vitro dell'embrione (IVC), durante la quale, gli embrioni di nuova formazione, raggiungono lo stadio di blastocisti. Dopo la fecondazione in vitro, gli embrioni possono essere trasferiti in riceventi attraverso il trasferimento embrionario o essere congelati per un uso successivo. Nonostante i potenziali progressi offerti dai sistemi IVP, la percentuale di successo nella specie bovina è rimasta pressoché stabile negli ultimi 30 anni ed è limitata ad un terzo degli ovociti isolati dall'ovaio che raggiungono lo stadio di blastocisti. Questa condizione è purtroppo comune ad altre specie. La qualità degli ovociti è cruciale per l'efficienza dei protocolli di IVP e la maturazione dell'ovocita rappresenta il primo processo limitante di tutto il sistema. Al momento della rimozione dai follicoli ovarici antrali, gli ovociti si trovano arrestati alla profase della prima divisione meiotica, la cosiddetta fase della vescicola germinale (GV), in cui la cromatina è racchiusa all'interno dell'involucro nucleare. Gli ovociti allo stadio GV abitualmente utilizzati nelle pratiche di IVP sono raccolti da follicoli antrali di medie dimensioni e, in quanto tali, devono ancora completare i passaggi finali di crescita e differenziamento necessari ad acquisire la cosiddetta "competenza di sviluppo", ossia il corredo di organuli e molecole necessario a sostenere la fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Inoltre, poiché lo sviluppo dei follicoli dei mammiferi avviene a ondate successive, uno dei fattori limitanti è rappresentato dall'eterogeneità intrinseca degli ovociti sottoposti a IVM e dalla mancanza di approcci in vitro dedicati per finalizzare il loro processo di differenziamento. Gli studi condotti durante il programma di dottorato mirano a definire parametri morfologici e funzionali non invasivi che possano essere utilizzati come marker del differenziamento degli ovociti e che possano essere considerati per migliorare l'efficienza delle tecniche attuali. Gli studi sono stati condotti sui modelli animali suino e bovino. In entrambe le specie, i cambiamenti progressivi nella configurazione su larga scala della cromatina, che caratterizzano il processo di differenziamento degli ovociti, sono stati utilizzati come marker di acquisizione della competenza allo sviluppo embrionale. In particolare, l'ipotesi di lavoro principale è stata quella di utilizzare la configurazione della cromatina come indicatore dell'eterogeneità della popolazione di ovociti sottoposti a IVM e di mettere a punto protocolli personalizzati di maturazione con maggiore efficienza ed efficacia, che consentissero di massimizzare lo sfruttamento della riserva ovarica. Nella prima parte di studi, sono stati caratterizzati i diversi pattern di configurazione della cromatina GV negli ovociti suini e queste informazioni sono state utilizzate per realizzare un protocollo di prematurazione in grado di migliorare la competenza allo sviluppo dell'ovocita. Nella seconda parte, nel modello bovino, sono stati studiati i profili di trascrizione delle cellule del cumulo basati sulla configurazione della cromatina nell’ovocita allo stadio di GV quali marker di competenza allo sviluppo embrionale. In questi studi, l'uso combinato dei parametri morfologici insieme all'analisi dei profili trascrittomici delle cellule del cumulo, ci ha permesso di convalidare un protocollo di coltura di base per la prematurazione dell'ovocita bovino. In conclusione, i nostri dati indicano che il miglioramento dell’efficienza dei protocolli di IVP richiede la selezione di una popolazione di ovociti più omogenea, che deve essere trattata considerando specifici bisogni colturali dell'ovocita, quindi progettando un sistema di prematurazione personalizzato. In particolare, i nostri risultati contribuiscono all'identificazione di specifici biomarcatori non invasivi dello stato di differenziamento e di salute dell'ovocita che possono fornire strumenti utili per la selezione di ovociti di buona qualità e per migliorare il potenziale riproduttivo nei mammiferi di interesse zootecnico.

Improving in vitro embryo production: the use of oocyte chromatin configuration and cumulus cell gene expression to set up customized pre-IVM protocols / C. Dieci ; tutor: A.M. Luciano ; co-tutor: V. Lodde ; coordinatore: F. Gandolfi. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE PER LA SALUTE, LA PRODUZIONE ANIMALE E LA SICUREZZA ALIMENTARE, 2018 May 25. ((28. ciclo, Anno Accademico 2017. [10.13130/dieci-cecilia_phd2018-05-25].

Improving in vitro embryo production: the use of oocyte chromatin configuration and cumulus cell gene expression to set up customized pre-IVM protocols

C. Dieci
2018

Abstract

L'efficienza delle tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) è ancora limitata sia in ambito zootecnico che in clinica umana. L'IVP consiste in 4 fasi principali in cui si verificano in laboratorio gli eventi chiave dello sviluppo di un nuovo organismo: 1) il recupero di ovociti immaturi (arrestati in profase I della divisione meiotica) da donatrici vive o isolati da ovaie raccolte da animali macellati; 2) la maturazione in vitro (IVM), cioè la coltura degli ovociti fino allo stadio di metafase II della meiosi; 3) la fecondazione in vitro (IVF) e 4) la coltura in vitro dell'embrione (IVC), durante la quale, gli embrioni di nuova formazione, raggiungono lo stadio di blastocisti. Dopo la fecondazione in vitro, gli embrioni possono essere trasferiti in riceventi attraverso il trasferimento embrionario o essere congelati per un uso successivo. Nonostante i potenziali progressi offerti dai sistemi IVP, la percentuale di successo nella specie bovina è rimasta pressoché stabile negli ultimi 30 anni ed è limitata ad un terzo degli ovociti isolati dall'ovaio che raggiungono lo stadio di blastocisti. Questa condizione è purtroppo comune ad altre specie. La qualità degli ovociti è cruciale per l'efficienza dei protocolli di IVP e la maturazione dell'ovocita rappresenta il primo processo limitante di tutto il sistema. Al momento della rimozione dai follicoli ovarici antrali, gli ovociti si trovano arrestati alla profase della prima divisione meiotica, la cosiddetta fase della vescicola germinale (GV), in cui la cromatina è racchiusa all'interno dell'involucro nucleare. Gli ovociti allo stadio GV abitualmente utilizzati nelle pratiche di IVP sono raccolti da follicoli antrali di medie dimensioni e, in quanto tali, devono ancora completare i passaggi finali di crescita e differenziamento necessari ad acquisire la cosiddetta "competenza di sviluppo", ossia il corredo di organuli e molecole necessario a sostenere la fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Inoltre, poiché lo sviluppo dei follicoli dei mammiferi avviene a ondate successive, uno dei fattori limitanti è rappresentato dall'eterogeneità intrinseca degli ovociti sottoposti a IVM e dalla mancanza di approcci in vitro dedicati per finalizzare il loro processo di differenziamento. Gli studi condotti durante il programma di dottorato mirano a definire parametri morfologici e funzionali non invasivi che possano essere utilizzati come marker del differenziamento degli ovociti e che possano essere considerati per migliorare l'efficienza delle tecniche attuali. Gli studi sono stati condotti sui modelli animali suino e bovino. In entrambe le specie, i cambiamenti progressivi nella configurazione su larga scala della cromatina, che caratterizzano il processo di differenziamento degli ovociti, sono stati utilizzati come marker di acquisizione della competenza allo sviluppo embrionale. In particolare, l'ipotesi di lavoro principale è stata quella di utilizzare la configurazione della cromatina come indicatore dell'eterogeneità della popolazione di ovociti sottoposti a IVM e di mettere a punto protocolli personalizzati di maturazione con maggiore efficienza ed efficacia, che consentissero di massimizzare lo sfruttamento della riserva ovarica. Nella prima parte di studi, sono stati caratterizzati i diversi pattern di configurazione della cromatina GV negli ovociti suini e queste informazioni sono state utilizzate per realizzare un protocollo di prematurazione in grado di migliorare la competenza allo sviluppo dell'ovocita. Nella seconda parte, nel modello bovino, sono stati studiati i profili di trascrizione delle cellule del cumulo basati sulla configurazione della cromatina nell’ovocita allo stadio di GV quali marker di competenza allo sviluppo embrionale. In questi studi, l'uso combinato dei parametri morfologici insieme all'analisi dei profili trascrittomici delle cellule del cumulo, ci ha permesso di convalidare un protocollo di coltura di base per la prematurazione dell'ovocita bovino. In conclusione, i nostri dati indicano che il miglioramento dell’efficienza dei protocolli di IVP richiede la selezione di una popolazione di ovociti più omogenea, che deve essere trattata considerando specifici bisogni colturali dell'ovocita, quindi progettando un sistema di prematurazione personalizzato. In particolare, i nostri risultati contribuiscono all'identificazione di specifici biomarcatori non invasivi dello stato di differenziamento e di salute dell'ovocita che possono fornire strumenti utili per la selezione di ovociti di buona qualità e per migliorare il potenziale riproduttivo nei mammiferi di interesse zootecnico.
LUCIANO, ALBERTO MARIA
GANDOLFI, FULVIO
The efficiency of in vitro embryo production (IVP) technologies is still limited in both livestock and humans. IVP consists of 4 major steps in which the key events of the development of a new organism occur in the laboratory: 1) the recovery of immature (prophase I arrested) oocytes from live donors or from isolated ovaries collected from dead animals; 2) the in vitro maturation (IVM), i.e. the culture of oocytes up to the metaphase II stage of meiosis; 3) the in vitro fertilization (IVF) and 4) the in vitro embryo culture (IVC), during which the newly formed embryos reach the blastocyst stage of development. After IVC, the embryos can be transferred to female recipients through embryo transfer or be frozen for later use. Despite the potential advances offered by IVP systems, the percentage of success in cow remained stunning stable over the last 30 years and is restricted to one third of the oocytes isolated from the ovary reaching the blastocyst stage of embryonic development. This limitation is similar in other species. The quality of the oocytes is crucial for IVP efficiency and the maturation of the oocyte represents the first key limiting step of the system. At the time of removal from the ovarian antral follicles, the oocytes are arrested at the prophase of the first meiotic division, the so called Germinal Vesicle (GV) stage, in which the chromatin is enclosed within the nuclear envelope. GV stage oocytes routinely used in IVP settings are collected from middle sized antral follicles and, as such, would still need to complete the final growth and differentiation steps, necessary to provide the so-called ‘developmental competence’, i.e. the machinery required to sustain fertilization and embryo development. Moreover, since mammalian follicle development occurs in waves, some of the limiting factors lie in the intrinsic heterogeneity of the oocytes that are subjected to IVM and in the lack of dedicated in vitro approaches to finalize their differentiation process. Studies conducted during the doctorate program aimed at defining morphological and functional non-invasive parameters that can be used as marker of oocyte differentiation and that can be considered to improve the efficiency of current techniques. The studies were conducted in porcine and bovine animal models. In both species, the progressive changes in large-scale chromatin configuration, that characterize the oocyte differentiation process, were used as a marker of differentiation and developmental potential acquisition. In particular, the main assumption was to utilize the chromatin configuration as an indicator of the heterogeneity of the oocyte population subjected to IVM and design customized IVM protocols with increased efficiency and efficacy, that would allow to maximize the exploitation of the oocyte reservoir. In the first part, the porcine oocyte GV chromatin configuration patterns were characterized, and this information was utilized for testing a pre-IVM protocol able to improve oocyte developmental competence. In the second part, the cumulus cells transcriptomic profiles based on the GV chromatin configuration as a marker of oocyte developmental competence were studied in the bovine model. In these studies, the combined use of morphological parameters together with the analysis of the transcriptomic profiles of cumulus cells allowed us to validate a basic oocyte culture protocol. In conclusion, our data indicate that the improvement of IVP outcome requires the selection of a more homogeneous oocyte population that must be treated considering specific oocyte cultural needs, so designing customized pre-IVM culture system. In particular, our findings contribute to the identification of specific non-invasive biomarker(s) of oocyte health status and final differentiation that can provide useful tools for the selection of good quality oocyte and to improve the reproductive potential in animal breeding.
Settore VET/01 - Anatomia degli Animali Domestici
Improving in vitro embryo production: the use of oocyte chromatin configuration and cumulus cell gene expression to set up customized pre-IVM protocols / C. Dieci ; tutor: A.M. Luciano ; co-tutor: V. Lodde ; coordinatore: F. Gandolfi. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE PER LA SALUTE, LA PRODUZIONE ANIMALE E LA SICUREZZA ALIMENTARE, 2018 May 25. ((28. ciclo, Anno Accademico 2017. [10.13130/dieci-cecilia_phd2018-05-25].
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