Sviluppo e validazione di una pipiline integrata in silico per la determinazione di affinità e attività intrinseca di xenobiotici sul recettore alfa degli estrogeni

La capacità di alcuni xenobiotici, caratterizzati da attività endocrina (Endocrine Active Substance, EAS), di legarsi al ligand binding domain (LBD) del recettore alfa degli estrogeni (ERα) è uno degli endpoint considerati nel progetto H2020 Euromix, finanziato dall’Unione Europea. In questo progetto, le previsioni in silico vengono utilizzate per classificare una vasta gamma di composti in gruppi di valutazione cumulativi (CAG). A questo scopo, è stata sviluppata una pipeline integrata di metodi in silico, che combini diversi modelli di (Q)SAR, con simulazioni di docking e di dinamica molecolare low-mode, in grado di raggiungere l’obiettivo attraverso un consenso di punteggi derivanti dai modelli. Per mettere a punto e calibrare questa pipeline sono stati utilizzati 52 composti di training, derivanti da un dataset specifico per un approccio (Q)SAR su ERα, a cui sono stati associati valori sperimentali d’affinità (RBA) e attività relativa (RA) rispetto al 17β-estradiolo, ormone naturale assunto quale composto di riferimento. Poiché sono stati utilizzati differenti modelli di (Q)SAR specifici per ERα, è stato impostato un punteggio di consenso interno alla metodologia. Questa predizione, caratterizzata da un buon bilanciamento tra sensibilità e specificità, ha mostrato un'elevata accuratezza. Tra i 52 composti di training, caratterizzati da valori di RBA sperimentali attivi, soltanto 12 venivano classificati come negativi per ERα, attraverso il punteggio consenso del (Q)SAR. Tra questi, 10 risultavano caratterizzati da valori negativi di RA in saggi specifici, configurandosi come antagonisti. Questi risultati suggeriscono che i modelli di (Q)SAR utilizzati siano poco efficaci nel classificare ligandi di ERα, dotate di attività intrinseca nulla. Il docking molecolare ha permesso di calcolare l’energia libera di legame (ΔG) di ciascun ligando rispetto ad ERα, basandosi sulla struttura tridimensionale della proteina e degli xenobiotici. La statistica di Cooper, calcolata scegliendo diversi valori di ΔG come cut-off per la classificazione, ha mostrato un valore massimo di accuratezza comparabile a quello del (Q)SAR. Il docking molecolare ha permesso anche di ottenere informazioni preziose sulla stabilità di legame dei complessi simulati, sulla base del valore di ΔG. Unendo i risultati di consenso del (Q)SAR con quelli docking molecolare, è stato possibile definire un punteggio di consenso globale tra i due approcci. Al fine di validare un metodo di predizione dell’attività intrinseca, sono stati analizzati 10 composti predetti come buoni ligandi, di cui 5 con valori di RA positivo (probabili agonisti) e 5 con valori di RA negativo (probabili antagonisti). Utilizzando simulazioni di dinamica molecolare low-mode è stata studiata la capacità di esplorazione dello spazio conformazionale dell’elica 12, che resta in conformazione chiusa per gli agonisti, mentre invece si dispone in conformazione aperta per gli antagonisti. Questa metodologia è stata validata su due composti di riferimento per il recettore degli estrogeni: il 17β-estradiolo (agonista naturale) ed il 4-idrossitamoxifene (antagonista). I nostri risultati mostrano che il punteggio di consenso globale dei modelli (Q)SAR e del docking molecolare è un buon metodo per predire se un composto è in grado di legare ERα, anche se non fornisce informazioni sull’attività intrinseca. Questo primo screening in silico ha il vantaggio di essere semplice e rapido, essendo basato da un lato su modelli (Q)SAR già disponibili e dall’altro sull’uso di (modelli di) struttura tridimensionale dei bersagli molecolari e dei composti. Con l’integrazione delle simulazioni di dinamica molecolare low-mode, si ha infine la possibilità di indagare approfonditamente, per un sottogruppo di composti, l’attività intrinseca al fine di aumentare il livello informazionale di questa pipeline in silico, utile a classificare i composti all’interno dei CAG.