GENERATION OF AUTHENTIC HUMAN NEOCORTICAL NEURONS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS TO INVESTIGATE 7Q11.23 GENE DOSAGE IMBALANCES

This research project has been aimed to investigate human neocortical development in healthy and diseased subjects by analyzing and comparing the transcriptional profiles and cellular morphologies of human neocortical cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Given the importance to rely on a solid and highly reproducible iPSCs-based differentiation protocol that generates authentic neocortical neurons in vitro with high efficiency before applying it as a model system of human neurodevelopmental disorders, in the first phase of this study we performed a comprehensive transcriptional, cellular and physiological characterization of the in vitro neurodevelopmental paradigm. The transcriptional dynamics regulating in vitro neocortical development have been investigated by performing RNA-sequencing (RNA-seq) at both population and single- cell level in combination with several bioinformatics analyses including principal component analysis (PCA), differential gene expression analysis and weighted gene co-expression network analysis (WGCNA). The transcriptional results were corroborated by the widespread positivity for a selected panel of informative cell-fate and cell-stage specific markers detected through immunocytochemistry and the physiological maturity of our iPSCs-derived neocortical neurons was further confirmed by their ability to generate action potentials, develop complex firing patterns and sustain excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity. Overall, these results fully validated the reproducibility of the differentiation protocol and its efficiency and reliability in generating physiologically mature authentic neocortical neurons. Subsequently, we applied this extensively characterized neocortical differentiation paradigm to model in vitro two human neurodevelopmental disorders caused by symmetrical copy number variations (CNVs) of the Williams-Beuren syndrome chromosome region (WBSCR) located on the long arm (q) of chromosome 7 at position 11.23 (7q.11.23 locus). 7q11.23 CNVs are of special interest as the two disorders resulting from the deletion (Williams syndrome, WS) and duplication (7q.11.23 duplication syndrome, 7q11DUP) of this region exhibit cognitive and behavioral phenotypes marked by both similar features and symmetrically opposite traits. The association of 7q11DUP to complex neurodevelopmental disorders such as autism spectrum disorder and schizophrenia, while WS is a well-characterized syndrome without clear overlap to complex neurodevelopmental disorders make the study of this locus extremely interesting to identify the molecular mechanisms unique to each clinical condition, common to both syndromes and shared with other complex neurodevelopmental disorders. To this aim, we generated several iPSCs lines from a large cohort comprising WS individuals, 7q11DUP patients and healthy subjects and differentiated them into neocortical neurons by applying the previously in-depth characterized protocol. Having assessed the quality of our iPSCs-derived neocortical neurons, we are currently identifying neuronal subtypes specific genes and gene networks having the most statistically significant relationship to these disorders through single cell RNA-sequencing analysis. Furthermore, morphometric analysis of WS and control iPSCs-derived neocortical neurons has confirmed in humans many neuronal morphological abnormalities observed in a mouse knockout for Dnajc30, a previously uncharacterized gene contained in the 7q11.23 locus.

Questo lavoro di tesi ha avuto lo scopo di studiare lo sviluppo della neocorteccia umana ed i meccanisimi alla base della sua compromissione che risultano nell’insorgenza di patologie del neurosviluppo mediante un’analisi dei profili trascrizionali e della morfologia di neuroni neocorticali umani generati a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Data l’importanza di basarsi su un paradigma di neurogenesi in vitro riproducibile e affidabile nel generare neuroni neocoritcali umani autentici, prima di adottare questo sistema modello per lo studio di patologie del neurosviluppo, nella prima fase di questa ricerca abbiamo eseguito un’ampia caratterizzazione trascrizionale, molecolare e funzionale del protocollo di differenziamento. Le dinamiche trascrizionali che regolano il neurosviluppo in vitro sono state studiate effettuando esperimenti di RNA-sequencing sia a livello di popolazione che di singola cellula. In combinazione con diverse analisi bioinformatiche tra cui l’analisi delle componeti principali (PCA), l’analisi dei geni differenzialemtne espressi e l’analisi WGCNA. L’analisi dei profili trascrizionali è stata accompagnata da un’ampia analisi di d’immunocitochimica che ha permesso di confermare l’identità e lo stadio di sviluppo delle cellule in coltura. Inoltre, la maturità funzionale dei neuroni derivati da iPSCs è stata ulteriormente confermata dalla loro capacità di generare potenziali d’azione, sostenere pattern di scarica complessi e sviluppare attività sinaptica spontanea eccitatoria ed inibitoria. Complessivamente, i risultati ottenuti da questo ampio e diversificato pannello di analisi hanno permesso di stabilitre la riproducibilità del protocollo di differenziamento e la sua competenza nel generare con elevata efficienza principalmente neuroni neocorticali autentici. Successivamente abbiamo applicato questo protocollo di differenziamento neocorticale come sistema modello per studiare due patologie del neurosviluppo dovute alla delezione e duplicazione di una regione comprendente circa 1.5 - 1.8 Mb (megabasi) collacata sul braccio lungo (q) del cormosoma 7 nella banda 11.23. Duplicazioni e delezioni di questa regione sono di particolare interesse in quanto le due sindromi che ne risultano, rispettivamente la sindrome di Willams (WS) e la sindrome da duplicazione 7q11.23 (7q11DUP), presentano fenotipi cognitivi e comportamentali caratterizzati da profili simili e tratti simmetricamente opposti. La frequente comorbidità della sindrome da duplicazione 7q11.23 con altre patologie del neurosviluppo come l’autismo e la schizofrenia in contrasto con la sindrome di Williams che è una sindrome ben caraterizzata non associata ad altre patologie del neurosviluppo, rende lo studio dell’ alterato dosaggio genico del locus 7q11.23 estremamente interessante per identificare con precisione i meccanismi molecolari caratteristici di ciascuna condizione clinica, condivisi da entrabme le sindromi e comuni anche ad altre patologie del neurosviluppo. A questo scopo, abbiamo generato diverse linee di iPS a partire da un ampio gruppo di individui, comprendente individui sani e pazienti affetti dalla sindrome di Williams (WS) e dalla sindrome di duplizazione 7q11.23, che sono poi state differenziate in neuroni neocorticali applicando il protocollo precedentemetne caraterizzato. Confermata l’identità e l’autenticità dei neuroni neocorticali generati da iPSCs, stiamo attualmente identificando i geni ed i meccanismi molecolari disregolati in specifici sottotipi di neuroni che abbiano la maggior rilvenza clinica. Inoltre, l’analisi morfologica dei neuroni neocorticali umani ottenuti da pazienti WS e soggetti sani ha permesso di confermare nell’uomo molte alterazioni morfologiche dei neuroni neocorticali osservate in un modello murino knockout per Dnajc30, un gene ancora funzionalmente non caraterizzato compreso nel locus 7q11.23.