ROLE OF PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 1 (PGRMC1) IN CONTROLLING GERMINAL AND SOMATIC CELL DIVISION AND FUNCTION.

Subfertility is one of the major problems that dairy industry is facing nowadays. Subfertility is a multifactorial issue depending on different aspects of reproductive function. Oocyte quality, which is determined during folliculogenesis, is certainly crucial for optimal reproductive outcome. Since declining fertility of cattle is mainly due to the poor quality of the oocytes, defining the factors and mechanisms that affect oocyte quality is essential to improve female fertility. In particular, basic knowledge of which proteins within the oocyte regulate meiosis, oocyte fertilizability and early embryonic development would be advantageous. In this project, we primarily considered the role of Progesterone Receptor Membrane Component-1 (PGRMC1) in both the oocyte and follicular compartment since the dialogue between the two compartments is one of the key factors involved in oocyte competence acquisition. PGRMC1 is a highly conserved and multifunctional protein that is found expressed in multiple systems, including reproductive organs, and localizes in multiple sub-cellular compartments. However, its role(s) and precise mechanism(s) of action in each systems and/or subcellular compartment are not yet fully understood. The more considerable part of this PhD project consists of studies on PGRMC1's involvement as a cell division regulator, according to its localization to the mitotic and meiotic spindle. We showed that PGRMC1 depletion leads to defective cell division in both oocyte and somatic cells and its action could be exerted during cytokinesis, the very last mitotic phase, as demonstrated by its association with Aurora kinase B (AURKB). During meiotic maturation, we also evaluated PGRMC1 involvement as a possible mediator of progesterone (P4) action, by comparing the effects of inhibiting its function with that of nuclear progesterone receptor's (nPGR) inhibition. Our data suggests that both receptors have an effect on meiotic progression but possibly at different stages of oocyte maturation. Moreover, we tested the hypothesis that PGRMC1 might modulate the function of the nucleolus. Immunofluorescence experiments confirmed PGRMC1 nucleolar localization in bovine granulosa cells (bGC) and bovine oocytes and its co-localization with nucleolin, the most abundant nucleolar protein exerting important functions in this subcellular compartment. Moreover, a PGRMC1/nucleolin functional association is suggested by PGRMC1's downregulation determining nucleolin shift from the nucleolus to the nucleoplasm. However, in situ proximity ligation assay did not detect a direct interaction between these two proteins, suggesting the involvement of additional molecules that could mediate PGRMC1/nucleolin interaction. Besides the main theme of this project, cell division is one of the most important processes in cancer biology and PGRMC1 is known to be overexpressed in many types of tumors in humans. Therefore, we studied its expression in different types of canine mammary tumors. Our preliminary results showed PGRMC1 expression decreases with the malignancy of the tumor and different PGRMC1 isoforms are present both in normal and tumoral tissue. To conclude, these findings suggest a role of PGRMC1 in the follicular compartment, being implicated in both meiotic and mitotic process of the germinal and somatic compartment, respectively. This action it is likely mediated by PGRMC1 located at a particular site of the spindle, i.e the midzone and /or the midbody of dividing cells. PGRMC1 also localizes at the nucleolus of both oocytes and granulosa cells where it likely exerts additional function(s) in mediating cellular stress and/or other nucleolar-relates process. Clearly these findings have major implication in the overall process of folliculogenesis. Moreover, PGRMC1's role as a regulator of cell proliferation could be relevant also in some diseases such as cancer. Further investigations will aim at investigating PGRMC1's molecular mechanisms of action in these processes to widen our knowledge on this multifaceted protein.

La sub-fertilità rappresenta uno dei principali problemi che l'industria lattiero-casearia si trova ad affrontare attualmente. Si tratta di un problema multifattoriale che dipende da diversi aspetti della funzione riproduttiva. La qualità dell'ovocita, determinata durante la follicologenesi, è sicuramente cruciale per ottenere risultati riproduttivi ottimali. Per migliorare la fertilità femminile nel bovino è fondamentale definire i fattori e i meccanismi che determinano la qualità del gamete femminile, in quanto il declino della funzione riproduttiva in questa specie è dovuto principalmente alla scarsa qualità degli ovociti. In particolare, è importante conoscere quali proteine regolano la meiosi, la fecondabilità e lo sviluppo embrionale dell'ovocita. In questo progetto, abbiamo considerato principalmente il ruolo del Progesterone Receptor Membrane Component-1 (PGRMC1) sia nell'ovocita che nel compartimento follicolare, considerato che il dialogo tra compartimento germinale e compartimento somatico è uno dei fattori chiave coinvolti nell'acquisizione della competenza allo sviluppo del gamete femminile. Il PGRMC1 è una proteina multifunzionale ed altamente conservata in specie anche filogeneticamente distanti. Nei mammiferi è espressa in diversi sistemi, compresi gli organi riproduttivi, e localizza in diversi compartimenti subcellulari. Tuttavia, il suo ruolo e il preciso meccanismo d'azione in ogni sistema e/o compartimento subcellulare non sono ancora del tutto conosciuti. La parte più considerevole di questo progetto di dottorato riguarda gli studi effettuati sul ruolo del PGRMC1 nella divisione cellulare, data la sua localizzazione a livello di fuso mitotico e meiotico. Abbiamo dimostrato che la deplezione del PGRMC1 determina difetti nella divisione cellulare e la sua interazione con l'Aurora chinasi B (AURKB) indica che potrebbe svolgere la sua azione durante la citodieresi, l'ultima fase della divisione. Durante la maturazione meiotica, abbiamo valutato anche il suo ruolo nel mediare l'azione del progesterone (P4) confrontando il suo effetto con quello del recettore nucleare del progesterone (nPGR). L'inibizione di entrambi i tipi di recettore determina lo stesso effetto sull'organizzazione della piastra metafasica e sulla competenza allo sviluppo dell'ovocita, ma in fasi differenti. Inoltre, abbiamo testato l'ipotesi che il PGRMC1 possa modulare la funzione del nucleolo. Studi di immunofluorescenza hanno confermato la presenza del PGRMC1 nel nucleolo di cellule della granulosa (bGC) e negli ovociti di bovino, nonchè la colocalizzazione con la nucleolina, la proteina nucleolare più abbondante che svolge importanti funzioni in questo compartimento subcellulare. Inoltre, la down-regolazione del PGRMC1 determina uno spostamento della nucleolina dal nucleolo al nucleoplasma suggerendo un'associazione funzionale tra queste due proteine. Questa interazione è probabilmente mediata dalla presenza di ulteriori molecole in quanto successivi esperimenti di "in-situ proximity ligation" mostrano che le due proteine non interagiscono direttamente. Oltre al tema principale di questo progetto, la divisione cellulare è uno dei processi più importanti anche nel cancro e l'espressione del PGRMC1 è elevata in molti tipi di tumore nell'uomo. Per questo abbiamo intrapreso uno studio preliminare per caratterizzare la sua espressione nei diversi tipi di tumore mammario di cane. In base ai nostri risultati, l'espressione del PGRMC1 diminuisce con l'aumentare della malignità del tumore e le diverse isoforme di PGRMC1 sono presenti sia nel tessuto sano che in quello neoplastico. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che il PGRMC1 può avere un ruolo nel compartimento follicolare, in particolare sia nella mitosi che nella meiosi. La sua funzione potrebbe essere legata alla sua localizzazione nucleolare, nonchè alla sua capacità di mediare l'azione del P4 durante la meiosi dell'ovocita. Il suo ruolo come regolatore della divisione cellulare può essere rilevante anche in alcune patologie quali il cancro. Ulteriori studi saranno diretti a valutare i meccanismi di azione molecolari tramite i quali il PGRMC1 agisce in questi processi al fine di ampliare la nostra conoscenza di questa proteina poliedrica.