CHARACTERIZATION OF NOVEL SMALL RNA BASED REGULATORY NETWORKS IN THE OPPORTUNISTIC PATHOGEN PSEUDOMONAS AERUGINOSA

In bacterial pathogens, small RNAs (sRNAs) are involved in the coordinate expression of the virulence factors underlying the interaction with host. Several sRNAs have been described in the human pathogen Pseudomonas aeruginosa, as integral part of the complex and intricate regulatory networks that represent the bedrock of its pathogenicity. This PhD project aimed to expand the knowledge about the recently described sRNA ErsA and to functional characterize the novel sRNA PesA which is transcribed within the pathogenicity island PAPI-1 of P. aeruginosa PA14 strain. ErsA is expressed in all the P. aeruginosa sequenced genomes, and in PAO1 it is responsive to infection-relevant host stimuli such as oxygen availability and temperature shift and its transcription is under the control of the alternative sigma factor σ22 (AlgT/U), a mediator of the stress response implicated in the bacterium pathogenicity. In addition, ErsA has been suggested to directly exert a negative post-transcriptional regulation on the virulence-associated algC gene encoding for the bifunctional enzyme AlgC implicated in alginate and exopolysaccharides biosynthesis for biofilm formation. Here, we investigated the multiple aspects of ErsA regulation in AlgC-related pathways, in particular biofilm formation, using a strategy based on in silico, in vivo and in vitro analyses, RNA-seq and phenotypic assays. Our combinatorial approach shows an interesting positive contribution of ErsA in biofilm development, likely by regulating at post-transcriptional level the AmrZ transcriptional regulator and resulting in altered transcriptional levels of genes belonging to the AmrZ regulon and crucial in biofilm formation as algD, and pel genes. In this study we characterized also a novel sRNA of P. aeruginosa PA14 named PesA. We show that PesA, which is transcribed within the pathogenicity island PAPI-1 of P. aeruginosa strain PA14, contributes to P. aeruginosa PA14 virulence and pathogenesis. Specifically, pesA gene deletion results in a less pathogenic strain, showing higher survival of cystic fibrosis human bronchial epithelial cells after infection compared to PA14 wildtype. Furthermore, ΔpesA is more sensitive to fluoroquinolone antibiotic ciprofloxacin and UV irradiation, this last is comparable to that of a strain deleted for pyoS3A-I. The pyoS3A-I locus encodes for pyocin S3 and we show that PesA influences the production of these bacteriocins positively regulating at post-transcriptional level the pyoS3A-I operon. On the whole, our results suggest a positive contribution of PesA in P. aeruginosa virulence and niche establishment. Furthermore, we suggest a potential involvement of pyocin S3 in DNA damage repair, introducing a link between DNA damage and repair modulated by PesA that has to be elucidated.

I piccoli RNA sono corte sequenze di RNA non codificante che regolano l’espressione di numerosi elementi coinvolti nella virulenza di batteri patogeni, in particolar modo quelli coinvolti nell’interazione con l’ospite. In Pseudomonas aeruginosa, patogeno opportunista che causa infezioni potenzialmente mortali in soggetti immunodepressi ed in pazienti affetti da fibrosi cistica, i piccoli RNA rivestono un ruolo di grande interesse nello scenario dei regolatori post-trascrizionali, modulando importanti meccanismi regolativi alla base della patogenesi di questo microrganismo. Il progetto di ricerca discusso in questa tesi di dottorato ha come obiettivo la caratterizzazione di due piccoli RNA di P. aeruginosa, denominati ErsA e PesA, conservati sia in ceppi clinici che ambientali. Come descritto in Ferrara et al. 2015, l’espressione di ErsA è sotto il controllo del fattore sigma “alternativo” σ22 (AlgT/U), implicato nella patogenesi in risposta a diversi stress ambientali, e l’espressione di ErsA viene modulata da segnali connessi con la transizione ambiente esterno ospite, cambiamenti della temperatura oppure modulazione dei livelli di ossigeno, Nel ceppo standard di laboratorio PAO1, ErsA regola negativamente a livello post-trascrizionale l’RNA messaggero (mRNA) di AlgC codificante per un enzima cruciale nella sintesi degli zuccheri utilizzati nella produzione di esopolisaccaridi, componente principale della matrice del biofilm batterico. Partendo da questo scenario, abbiamo usato diverse strategie sperimentali per delineare in modo più dettagliato il contributo di ErsA nella formazione di biofilm come analisi in silico, in vivo ed in vitro, corroborate da studi fenotipici e genetici (RNA-sequencing) eseguiti su un ceppo di PAO1 deleto del gene codificante per ErsA (PAO1 ΔersA). I risultati ottenuti dall’analisi fenotipica, suggeriscono un’influenza positiva di ErsA sul corretto sviluppo del biofilm di P. aeruginosa, presumibilmente modulando a livello post-trascrizionale l’espressione di AmrZ, identificato come nuovo target diretto di ErsA. AmrZ è un regolatore trascrizionale che controlla l’espressione di numerosi geni coinvolti nella produzione di strutture necessarie allo sviluppo del biofilm batterico, alcuni dei quali risultano essere deregolati in assenza di ErsA come emerso dall’analisi del profilo trascrizionale del ceppo PAO1 ΔersA. In parallelo allo studio su ErsA, abbiamo caratterizzato anche un secondo piccolo RNA, PesA, codificato dall’isola di patogenicità PAPI-1 del ceppo PA14. I nostri risultati mostrano che la delezione di pesA in PA14 (PA14 ΔpesA) determina una minore virulenza del ceppo rispetto al suo corrispondente wild-type, come evidenziato dall’alta percentuale di sopravvivenza delle cellule epiteliali bronchiali derivate da pazienti affetti da fibrosi cistica in seguito all’infezione con il ceppo PA14ΔpesA. Inoltre, abbiamo evidenziato una regolazione positiva che PesA esercita sull’operone pyoS3A-I deputato alla produzione di piocine S3, batteriocine importanti per la virulenza e la colonizzazione di nuove nicchie ecologiche. Infine, la mancanza di PesA contribuisce alla maggiore sensibilità all’antibiotico fluorochinolone ciprofloxacina e al trattamento con raggi UV suggerendo un potenziale coinvolgimento delle piocine S3 nella riparazione dei danni al DNA.