TESTUDINID HERPESVIRUS 3: DETECTION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF STRAINS IN ITALIAN TESTUDO SPP.

Herpesvirales is an ancient group of DNA viruses that infect different animal species, including reptiles. The Alphaherpesvirus is the major subfamily of Herpesvirales involved in reptile infections, and responsible for the onset of variably severe necrotizing lesions, affecting different body parts, and frequently associated with the animal's death. The death of the animal can be caused directly by the effect of the virus, or more frequently by the onset of secondary bacterial infections. Today, the reptile species most commonly kept as household pets are tortoises, lizards, and snakes. Compared to the owners of the other two groups of reptiles, at least in Europe, pet tortoise owners frequently buy animals that are collected from the wild (especially exotic species) and are also prone to abandon these animals into the wild. Moreover, good breeding practices are frequently not applied to reptile breeding centers, which commonly introduce new animals in their enclosure without testing and/or quarantining the animals. These habits have different consequences, including spreading both exotic and non-exotic diseases on Italian soil. Among all viruses infecting chelonians, herpesviruses are the group with the highest number of members, with more than five groups affecting turtles and tortoises. International literature re-ports herpesviruses as one of the most relevant causes of death in chelonians. Despite the relevance of the disease from both a conservational and economical point of view, no information is available on the presence of these viruses in Italy, and very little is known about the genetic characteristics and the host-pathogen interaction mechanisms. This work aims to identify the presence of Testudinid herpesviruses (TeHVs) in Italy, characterize the genome of the virus, and start to understand the host-pathogen interaction mechanisms between TeHV3 and Testudo graeca. To evaluate the presence of TeHVs in Italy, we carried out a prospective study, performing the ELISA test on live animals in the WWF Vanzago's Oasis, combined with PCR on both prospective and retrospective samples collected from the archive of the anatomical pathology section of the University of Milan. Complete necropsy and histological evaluation were performed on all prospective samples after their natural death. Furthermore, viral isolation was successfully carried out on one of the Vanzago cases. Using both TeHV3 strains collected in Italy, USA, and Switzerland, complete genome sequencing was performed. Evaluation of T. graeca immune response against TeHV3 was evaluated by creating a bacteriophage expression library screened with hyperimmune tortoise sera, obtained from a previous transmission study. Our study demonstrates that from both the prospective and retrospective samples, all that were positive were TeHV3, but one retrospective sample was TeHV1 positive. TeHV3 genome sequencing demonstrated that the viral genome is at least 150,080 nucleotides long, arranged in a D-type configuration, and extensively co-linear with the human herpesvirus 1 genome. From an immunological point of view, we were able to identify three relevant TeHV3 candidate antigenic proteins, TE-17, UL-15, and gB. Although we initially supposed the gB was the most relevant antigenic protein in T. graeca immune response against TeHV3, further investigation showed that the gB sequence in the evaluated phagemid was antisense compared to the origin of replication, and could not be transcribed. To assess the possible immunological relevance of TeHV3 gB protein in boosting host immune response, we performed enzymatic restriction, PCR cloning and PCR direct site mutagenesis on the original phagemid, to obtain new structures containing only one of the three possible immunogenic proteins previously identified. Despite the numerous attempts and techniques used, we are currently not able to obtain viable bacteria to confirm our hypothesis.

Gli Herpesvirales sono un gruppo di virus a DNA ontogeneticamente antico, in grado di infettare diverse specie animali inclusi i rettili. Tra le diverse famiglie di herpesvirus gli Alphaherpesvirus sono la sottofamiglia di Herpesvirales maggiormente coinvolta nelle infezioni di rettili e sono re-sponsabili di lesioni necrotizzanti di gravità variabile a carico di diversi organi; spesso le lesioni portano a morte il soggetto sia a causa dei danni indotti direttamente dal virus che per l'insorgenza di infezioni batteriche secondarie. Tra tutte le specie di rettili le tartarughe, le lucer-tole e i serpenti sono gli animali domestici più comuni. I proprietari di tartarughe sono, tra le tipologie di proprietari di rettili, quelli più proni ad acquistare animali prelevati in natura e ad abbandonare specie alloctone sul territorio. Inoltre, sono presenti numerosi allevamenti amatoriali di queste specie che non rispettano le buone norme di allevamento e introducono animali senza effettuare regolare quarantena. La somma di questi comportamenti ha avuto molteplici conse-guenze, tra le quali la diffusione di malattie esotiche e non esotiche nelle popolazioni autoctone di cheloni. Tra tutti i virus che possono causare infezioni nelle tartarughe, gli Herpesvirus sono i maggior-mente rappresentati, con 5 gruppi in grado di infettare testuggini terrestri e acquatiche. Inoltre, sulla base di quanto riportato in letteratura, gli herpesvirus sono una delle principali cause di morte tra i cheloni. Sebbene questi agenti eziologici abbiano un ruolo di rilievo sia da un punto di vista della bioconservazione che economico, non sono presenti informazioni sulla presenza del virus in Italia e, in linea generale, pochissime informazioni sono disponibili sulle caratteristiche genetiche e sui meccanismi di interazione ospite-patogeno. Questo lavoro ha lo scopo di identificare la presenza di Testudinid herpesvirus (TeHVs) in Italia, caratterizzare il genoma del virus ed iniziare ad investigare i meccanismi di interazione ospi-te-patogeno tra TeHV3 e Testudo graeca. Per valutare la presenza dei TeHVs in Italia, abbiamo effettuato uno studio prospettico effet-tuando test ELISA e PCR su tutte le tartarughe presenti nell'Oasi WWF di Vanzago ed abbiamo fatto, inoltre, uno studio retrospettivo effettuando la PCR sui campioni d'archivio dell'Istituto di Anatomia Patologica Veterinaria dell'Università di Milano. Esame necroscopico ed istopatologi-co completo sono stati effettuati su tutti i soggetti deceduti spontaneamente provenienti dall'Oasi di Vanzago. Inoltre, da uno dei soggetti provenienti dall'Oasi è stato possibile effettuare l'isolamento virale. Utilizzando ceppi di TeHV3 provenienti da Italia, USA e Svizzera, è stato possibile sequenziare il genoma di TeHV3. La valutazione dell'interazione ospite-patogeno è stata fatta utilizzando una libreria fagica screenata con siero iperimmune di T. graeca, ottenuto da uno studio di trasmissione precedente. Il nostro studio ha dimostrato che tutti i campioni positivi, sia prospettici che retrospettivi, erano positivi per TeHV3, tranne un caso retrospettivo positivo per TeHV1. . Il genoma di TeHV3 è risultato essere lungo, circa, 150.080 nucleotidi, con una configurazione genomica di tipo D ed è risultato altamente colineare con il genoma dell'Human herpesvirus 1. Da un punto di vista immunologico, abbiamo individuato tre potenziali proteine responsabili della risposta immunitaria dell'ospite, TE-17, UL-15 e la gB. Sebbene si fosse inizialmente ritenuto che la gB fosse la principale proteina responsabile della risposta immunitaria, valutazioni successive hanno dimostrato che l'orientamento della sequenza che codifica per la gB nel fagemide fosse antisenso e che, quindi, non potesse essere trascritta. Per valutare il possibile ruolo antigenico di gB, il fagemide originale è stato modificato in modo tale da contenere un solo frammento codificante. Le tecniche utilizzate per modificare il fagemide sono state: restrizione enzimatica, clonaggio con PCR e direct site mutagenesis con PCR. Sebbene siano stati fatti numerosi tentativi e utilizzate metodologie differenti, a tutt'oggi, non è stato possibile ottenere colonie batteriche contenti il fagemide modificato e, quindi, non è stato possibile confermare l'ipotesi originale.