MOLECULAR HETEROGENEITY OF MULTIPLE MYELOMA: THE BIOLOGICAL AND CLINICAL RELEVANCE OF NOVEL GENE MUTATIONS BY NEXT GENERATION SEQUENCING

Multiple myeloma (MM) is a fatal malignant proliferation of antibody-secreting bone marrow (BM) plasma cells (PCs) characterized by a wide clinical spectrum and a profound genomic instability. Concerning in particular the mutational landscape, recent next generation sequencing (NGS) studies in MM patients indicated the lack of a universal driver mutation but several recurrently mutated genes belonging to key pathways involved in the disease, such as the MAP-kinase pathway. MM characterization currently depends on BM aspirates for mutational analysis. However, this approach might not capture the putative spatial and genetic heterogeneity of the disease, and imposes technical hurdles that are limiting its transfer in the routine and clinical grade diagnostic laboratory, restricting also the possibility of longitudinal monitoring of disease molecular markers. Nevertheless, recent data produced in solid cancers indicate that circulating tumor DNA into the peripheral blood (PB) can be used as source of tumor DNA to provide information about tumor mass, residual disease and tumor genotype, with obvious advantages in terms of accessibility. Based on the previous observations, the aims of the project were: (i) the evaluation of the incidence of mutations in MM driver genes (KRAS, NRAS, TP53, BRAF, FAM46C and DIS3) in a large and representative cohort of patients at different stages of PC dyscrasia (132 MM and 24 primary PC leukemia (pPCL) cases, both at onset, and 11 secondary PCL (sPCL) patients); (ii) the comparison of the mutational profiling of circulating cell free DNA (cfDNA) and BM derived DNA in a small series of patients representative of different clinical stages of PC tumors. Specifically, we evaluated, by means of deep NGS, the incidence of mutations in BRAF (exons 11 and 15), NRAS (exons 2 and 3) and KRAS (exons 2-4), DIS3 in the PIN (exons 1-4) and RNB (exons 10-18) functional domains, TP53 (exons 4-9) and FAM46C (exon 2). Overall, the MAPK pathway resulted affected in 60.1% of the patients (63.6% of those with sPCL, 59.8% of those with MM, and 41.7% of those with pPCL). In particular, 12% of patients were found mutated in BRAF, 23.9% in NRAS, and 29.3% in KRAS. DIS3 mutations were found, respectively, in 18.5% of MM patients at diagnosis, 25% of pPCLs and 30% of sPCLs, occurring more frequently in IGH-translocated/nonhyperdiploid patients. Twenty-four tumour-specific mutations were identified in FAM46C affecting 18/162 (11%) patients. In particular, the frequency of FAM46C mutations was 11.7% in newly diagnosed MM, 4.2% and 20% in primary and secondary PCL, respectively. TP53 was mutated in 4/129 (3%) MM, 6/24 (25%) pPCL, and 2/10 (20%) sPCL cases. A similar increase in prevalence associated with disease aggressiveness (5%, 29.2% and 44%, respectively) was observed for TP53 deletion. In all analyzed genes, co-existing mutations tended to occur at different variant allele frequencies (VAFs), thus supporting the occurrence of tumor subclones. Longitudinal analysis at diagnosis and relapse in a subset of 19 cases including both MM and PCL cases, revealed different mutation patterns in BRAF/NRAS/KRAS. We observed the presence of clonal variants at both time-points; the acquisition/clonal expansion of variants in the later sample; and even the disappearance of variants at relatively high VAF values, but always concurrently with the emergence/clonal expansion of an additional mutation in another gene of the MAPK pathway. These longitudinally analysis highlighted some instances of increasing DIS3 mutation burden during disease progression. On the contrary, in FAM46C we observed a reduction or disappearance of three primary mutations with a quite constant VAF in cases at onset; instead, we noticed the acquisition of TP53 mutations in three of the nineteen cases analyzed at relapse. The majority of BRAF/DIS3/FAM46C variants in mutated cases were comparably detectable at transcriptional level. Overall, the finding that FAM46C mutated alleles had detectable biological expression, and in some cases seemed to be even preferentially transcribed, suggests that the mutations identified herein may have functional implications. The study on cfDNA as an accessible source of genomic material in MM patients was based on a series of 28 patients with PC disorders, of whom we collecteded: (1) cfDNA isolated from plasma; (2) tumor genomic (g)DNA from CD138+ purified BM PCs for comparative purposes, and (3) germline gDNA extracted from PB granulocytes, to filter out polymorphisms. CAPP-seq ultra-deep targeted NGS approach was performed to genotype a gene panel specifically designed to maximize the mutation recovery in PC tumors. Overall, within the interrogated genes, 18/28 (64%) patients had at least one non-synonymous somatic mutation detectable in cfDNA. Consistent with the spectrum of mutated genes in PC disorders, plasma cfDNA genotyping revealed somatic variants of NRAS (25%); KRAS (14%); TP53, TRAF3 and FAM46C (11%, respectively); CYLD and DIS3 (7%, respectively); and BRAF and IRF4 (4%, respectively). cfDNA genotyping correctly identified 72% of mutations (n=28/39) discovered in tumor PCs and, overall, the VAFs in plasma samples correlated with those in tumor biopsies. Notably, the remaining mutations not discovered in cfDNA had a low representation in the purified BM PCs (median VAF=2.5%). ROC analysis showed that cfDNA genotyping had the highest sensitivity (100%) if mutations were represented with a VAF >5% in purified BM PCs. The results of our study confirm and extend previous published evidence that MAPK pathway activation is recurrent in MM, and the finding that it is mediated by BRAF mutations in a significant fraction of patients has potentially immediate clinical implications. Furthermore, gene expression profiling analysis in DIS3-mutated patients identified a transcriptional signature suggestive for impaired RNA exosome function. Our data further support the pathological relevance of DIS3 mutations in PC dyscrasia and suggest that DIS3 may represent a potential tumor suppressor gene in such disorders. It is also strengthened the growing evidence that FAM46C is involved in the pathogenesis of MM as a potential tumour suppressor, although its role remains to be clarified. Our outcomes also confirm that TP53 mutations are rare in MM at presentation and rather represent a marker of progression, similarly to del(17p); however, their occurrence even in absence of deletions supports the importance of their assessment in patients with PC dyscrasia, in terms of both risk stratification and therapeutic implications. Our results demonstrate as well that cfDNA genotyping is a feasible, non-invasive, real-time approach able to detect clonal and subclonal somatic mutations represented in at least 5% of alleles in tumor PCs, thus supporting the advisable introduction of this method in clinical trials monitoring PC dyscrasia.

Il mieloma multiplo (MM) è una proliferazione maligna fatale delle plasmacellule (PC) secernenti anticorpi del midollo osseo (BM), caratterizzata da un ampio spettro clinico e da una profonda instabilità genomica. Per quanto riguarda in particolare il panorama mutazionale, recenti studi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) nei pazienti con MM hanno indicato la mancanza di una mutazione pilota universale, ma diversi geni mutati ricorrenti appartenenti a percorsi chiave coinvolti nella malattia, come la via MAP-chinasi. La caratterizzazione del MM attualmente si basa sull'analisi mutazionale effettuata sugli aspirati di BM. Tuttavia, questo approccio potrebbe non catturare la presunta eterogeneità spaziale e genetica della malattia e imporre ostacoli tecnici che ne limitano il trasferimento nel laboratorio diagnostico di routine e clinico, riducendo anche la possibilità di un monitoraggio longitudinale dei marcatori molecolari della malattia. Ciononostante, recenti dati relativi a cancri solidi indicano che il DNA circolante nel sangue periferico (PB) può essere usato come fonte di DNA tumorale per fornire informazioni sulla massa tumorale, sulla malattia residua e sul genotipo tumorale, con ovvi vantaggi in termini di accessibilità. Sulla base delle osservazioni precedenti, gli obiettivi del progetto erano: (i) la valutazione dell'incidenza delle mutazioni nei geni “driver” del MM (KRAS, NRAS, TP53, BRAF, FAM46C e DIS3) in una coorte ampia e rappresentativa di pazienti a diversi stadi di discrasia plamacellulare (132 MM e 24 casi di leucemia plasmacellulare primaria (pPCL), entrambi all'esordio, e in 11 pazienti con PCL secondaria (sPCL)); (ii) il confronto del profilo mutazionale del DNA libero da cellule circolante (cfDNA) e del DNA derivato dal BM in una piccola serie di pazienti rappresentativa di diversi stadi clinici di tumori plasmacellulari. Nello specifico, abbiamo valutato, mediante NGS ad alta profondità, l'incidenza di mutazioni in BRAF (esoni 11 e 15), NRAS (esoni 2 e 3) e KRAS (esoni 2-4), DIS3 nei domini funzionali PIN (esoni 1-4) e RNB (esoni 10-18), TP53 (esoni 4-9) e FAM46C (esone 2). Complessivamente, la via MAPK è risultata affetta da mutazioni nel 60,1% dei pazienti (63,6% di quelli con sPCL, 59,8% di quelli con MM e 41,7% di quelli con pPCL). In particolare, il 12% dei pazienti è stato trovato mutato in BRAF, il 23,9% in NRAS e il 29,3% in KRAS. Mutazioni di DIS3 sono state riscontrate, rispettivamente, nel 18,5% dei pazienti con MM alla diagnosi, nel 25% delle pPCL e nel 30% delle sPCLs, con una maggior frequenza nei pazienti IGH-traslocati/non iperdiploidi. In FAM46C sono state identificate 24 mutazioni tumore-specifiche interessanti 18/162 (11%) pazienti. In particolare, la frequenza delle mutazioni di FAM46C era dell'11,7% nei MM di nuova diagnosi, e del 4,2% e del 20%, rispettivamente, nelle PCL primarie e secondarie. TP53 era mutato in 4/129 (3%) MM, 6/24 (25%) casi di pPCL e 2/10 (20%) di sPCL. Una frequenza simile associata all'aggressività della malattia (5%, 29,2% e 44% rispettivamente) è stata osservata per la delezione di TP53. In tutti i geni analizzati, le mutazioni coesistenti tendevano a verificarsi a diverse frequenze di varianti alleliche (VAFs), sostenendo in tal modo la presenza di subcloni tumorali. L'analisi longitudinale alla diagnosi e alla recidiva in un sottogruppo di 19 pazienti, che includeva casi di MM e PCL, ha rivelato diversi modelli di mutazione in BRAF/NRAS/KRAS. Abbiamo osservato la presenza di varianti clonali ad entrambe le tempistiche; l'acquisizione/espansione clonale delle varianti nel campione successivo; e persino la scomparsa di varianti a valori di VAF relativamente alti, ma sempre in concomitanza con l'emergenza/l’espansione clonale di un'ulteriore mutazione in un altro gene della via MAPK. Queste analisi longitudinali hanno evidenziato alcuni casi di aumento del carico di mutazione di DIS3 durante la progressione della malattia. Al contrario, in FAM46C abbiamo osservato una riduzione o scomparsa di tre mutazioni primarie con una VAF abbastanza costante nei casi all'esordio; invece, abbiamo notato l'acquisizione di mutazioni di TP53 in tre dei diciannove casi analizzati in recidiva. La maggior parte delle varianti di BRAF/DIS3/FAM46C nei casi mutati erano comparabilmente rilevabili a livello trascrizionale. Complessivamente, la scoperta che gli alleli mutati di FAM46C avevano un'espressione biologica rilevabile e, in alcuni casi, sembrava addirittura trascritta preferenzialmente, suggerisce che le mutazioni qui identificate possono avere implicazioni funzionali. Lo studio sul cfDNA come fonte accessibile di materiale genomico nei pazienti con MM è stato condotto su una serie di 28 pazienti con disordini plasmacellulari, dei quali abbiamo raccolto: (1) cfDNA isolato dal plasma; (2) DNA genomico (gDNA) tumorale da PC di BM CD138+ purificate, per scopi comparativi e (3) gDNA germinale estratto da granulociti da PB, per filtrare i polimorfismi. L'approccio “NGS CAPP-seq ultra-deep targeted” è stato eseguito per genotipizzare un pannello genico specificamente progettato per massimizzare l’identificazione delle mutazioni nei tumori plasmacellulari. Complessivamente, all'interno dei geni interrogati, 18/28 (64%) pazienti avevano almeno una mutazione somatica non sinonima rilevabile nel cfDNA. Coerentemente con lo spettro dei geni mutati nei disordini delle PC, la genotipizzazione del cfDNA nel plasma ha rivelato varianti somatiche di NRAS (25%); KRAS (14%); TP53, TRAF3 e FAM46C (11%, rispettivamente); CYLD e DIS3 (7%, rispettivamente); e BRAF e IRF4 (4%, rispettivamente). La genotipizzazione del cfDNA ha identificato correttamente il 72% delle mutazioni (n=28/39) rilevate nelle PC tumorali e, nel complesso, le VAFs nei campioni di plasma correlavano con quelle delle biopsie tumorali. Va notato che le rimanenti mutazioni non rilevate nel cfDNA avevano una bassa rappresentazione nelle PC midollari purificate (VAF mediana=2,5%). L'analisi ROC ha mostrato che la genotipizzazione di cfDNA aveva la massima sensibilità (100%) se le mutazioni erano rappresentate con una VAF> 5% nelle PC di BM purificate. I risultati del nostro studio confermano ed estendono le evidenze pubblicate in precedenza che l'attivazione del pathway delle MAPK è ricorrente nel MM, e la scoperta che essa è mediata da mutazioni in BRAF in una frazione significativa di pazienti ha implicazioni cliniche potenzialmente immediate. Inoltre, l'analisi del profilo di espressione genica in pazienti DIS3-mutati ha identificato una “signature” trascrizionale suggestiva per la riduzione della funzione dell’esosoma dell'RNA. I nostri dati supportano ulteriormente la rilevanza patologica delle mutazioni di DIS3 nelle discrasie plasmacellulari e suggeriscono che DIS3 possa rappresentare un potenziale gene soppressore del tumore in tali disordini. E 'anche rafforzata la crescente evidenza che FAM46C sia coinvolto nella patogenesi del MM come potenziale gene oncosoppressore, anche se il suo ruolo rimane da chiarire. I nostri risultati confermano anche che le mutazioni di TP53 sono rare nel MM all’esordio e rappresentano piuttosto un marker di progressione, analogamente alla del(17p); tuttavia, il loro verificarsi anche in assenza di delezioni supporta l'importanza della loro valutazione in pazienti con discrasia plasmacellulare, in termini sia di stratificazione del rischio sia di implicazioni terapeutiche. I nostri risultati dimostrano anche che la genotipizzazione di cfDNA è un approccio fattibile, non invasivo, in tempo reale in grado di rilevare mutazioni somatiche clonali e subclonali rappresentate in almeno il 5% degli alleli nelle PC tumorali, supportando così la consigliabile introduzione di questo metodo negli studi clinici che monitorano le discrasie plasmacellulari.