PROTEOMIC INVESTIGATION ON NASU-HAKOLA DISEASE: SHEDDING LIGHT ON FRONTOTEMPORAL TREM2-BASED DEMENTIA.

Nasu-Hakola Disease (NHD), also known as Polycystic Lipomembranous Osteodysplasia with Sclerosing Leukoencephalopathy (PLOSL), is a recessively inherited systemic leucodystrophy disorder characterized by a combination of frontotemporal presenile dementia and lytic bone lesions. It is known that NHD is genetically related to a structural defect of TREM2 and DAP12 genes that encode for different subunits of the membrane receptor signalling complex expressed by microglia and osteoclast cells. To date, molecular or proteomic studies about this disorder are absent or scarce, and only case reports based on neuropsychological and genetic tests have been reported. In light of this, to obtain in depth knowledges about the onset and/or progression of the NHD, the aim of this PhD project was to characterize the Lymphoblastoid proteome of an entire family in which two members manifested a NHD phenotype, through an innovative proteomic approach. The project was focused on the proteomic analysis of Lymphoblastoid cell lines (LCLs) obtained from 7 kin subjects: two homozygote (Ho), four heterozygote (He) and one wild type (Wt). Gel-free proteomic approach, based on MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology), was applied for the analysis of the whole protein extract. The identification of peptide sequences and their assigned proteins was obtained through an automated protein discovery software (Bioworks) based on SEQUEST algorithm for data handling of mass spectra. Protein lists were submitted to bioinformatics analysis by means of a home-made software (MAProMa, Multidimensional Algorithm Protein Map) and available on-line tools, in order to highlight the protein expression trends and the most involved pathways in the NHD onset and/or progression. The application of a gel-free proteomic approach on NHD subjects allowed to identify about 3000 distinct proteins within the three analysed groups and about 400 proteins were identified as peculiar of each category (Ho, He, Wt). Of note, data showed the presence of differentially expressed proteins associated to neurodegenerative processes. Moreover, the protein networks highlighted some molecular pathways that could be involved in the onset or progression of this rare frontotemporal disorder. Therefore, the fully automated MudPIT platform has demonstrated its effectiveness in the study of the protein expression profiles of NHD patients and could be a valid platform for the investigation of other TREM2-based frontotemporal dementias. This approach allowed to generate, for the first time, the whole protein profile of Lymphoblastoid cells from Nasu-Hakola subjects and to characterize the metabolic pathways involved in functional alterations of this pathology.

La malattia di Nasu-Hakola (NHD), nota anche come osteodisplasia lipomembranosa policistica con leucoencefalopatia sclerosante (PLOSL), è una patologia sistemica ereditaria recessiva caratterizzata da demenza presenile frontotemporale e lesioni ossee. Le basi genetiche che determinano la patologia sono correlate ad un difetto strutturale di due geni, TREM2 e DAP12, che codificano per due subunità del recettore transmembrana di un complesso di segnalazione espresso dalle cellule della microglia e dagli osteoclasti. Ad oggi, studi molecolari o proteomici di questa malattia sono assenti o scarsi, infatti in letteratura sono riportati solo studi cognitivo-comportamentali e genetici di singoli pazienti. Con l’obiettivo di ottenere maggiori informazioni circa l'insorgenza e/o la progressione dell’NHD, lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di caratterizzare il proteoma linfoblastoide di un'intera famiglia in cui due membri hanno manifestato un fenotipo NHD. Il progetto è stato focalizzato sull'analisi proteomica della linea cellulare linfoblastoide (LCL) ottenuta da 7 soggetti: due omozigoti (Ho), quattro eterozigoti (He) ed un wildtype (Wt). L'approccio proteomico utilizzato è gel-free e basato sulla tecnologia MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) che si avvale della combinazione di micro-cromatografia liquida bidimensionale e spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione. L'identificazione delle sequenze peptidiche e delle relative proteine è stata ottenuta tramite un software (Bioworks) basato sull'algoritmo SEQUEST per l’interpretazione degli spettri di massa acquisiti. Le liste proteiche sono state sottoposte all'analisi bioinformatica mediante software sviluppati in laboratorio (MAProMa, Multidimensional Algorithm Protein Map) e/o disponibili in rete, allo scopo di evidenziare gli andamenti di espressione proteica e le vie metaboliche coinvolte nell'insorgenza e/o progressione dell’NHD. Lo studio ha permesso di identificare circa 3000 proteine distinte all'interno dei tre gruppi analizzati e circa 400 proteine sono state identificate come peculiari di ciascuna categoria (Ho, He, Wt). In particolare, i dati hanno evidenziato la presenza di proteine differenzialmente espresse associate a processi correlabili alla neurodegenerazione. Inoltre, le reti proteiche hanno messo in rilievo alcune via molecolari che potrebbero essere coinvolte nell'insorgenza o nella progressione di questo raro disordine frontotemporale. Pertanto, la piattaforma MudPIT, completamente automatizzata, ha dimostrato la sua efficacia nello studio dei profili di espressione proteica di pazienti affetti da NHD e si può candidare come valida piattaforma per lo studio di altre demenze frontotemporali legate a TREM2. Infatti, questo approccio ha consentito di generare, per la prima volta, il profilo proteico più completo delle cellule linfoblastoidi appartenenti a soggetti Nasu-Hakola e di caratterizzare le vie metaboliche coinvolte nelle alterazioni funzionali di questa patologia.