NEW INTEGRATED APPROACHES FOR THE DEVELOPMENT OF BIOCATALYTICAL PROCESSES

This PhD project has been structured into three parts preceded by a general introduction on basic biocatalysis concepts. Part 1: The recombinant preparation coupled with biochemical and structure characterization a thermostable carboxylesterase (BCE) from Bacillus coagulans NCBI 9365. This enzyme showed high enantioselectivity towards different 1,2-O-isopropylideneglycerol esters (acetate, butyrate and benzoate). Both enantiopure of 1,2-O-isopropylideneglycerol (IPG or solketal), a chiral equivalent of glycerol, are building blocks for the synthesis of -blockers, glycerophospholipids and prostaglandins. Part 2: An insight on the biocatalytic potential of Acetic Acid Bacteria (AAB), a group of bacteria well-known for the ability to oxidize primary and secondary alcohols into partially oxidized organic compounds (aldehydes, carboxylic acids and ketones) as end-products. This part collect three chapters: • the stereoselective desymmetrisation of achiral 2-alkyl-1,3-diols performed by oxidation of one of the two enantiotopic primary alcohol moieties by means of Acetobacter aceti MIM 2000/28 free whole cells to afford the corresponding chiral 2-hydroxymethyl alkanoic acids in batch system • Chemoenzymatic flow synthesis of enantiomerically pure captopril, a widely used antihypertensive drug, with the particular focus on the enzymatic step carried on with immobilized cells of Acetobacter aceti MIM 2000/28 used in a continuous flow reactor. • Productivity and stability of the air-liquid flow system setted up in the previous work, has been studied and optimized, through the use of immobilized form Acetobacter aceti MIM 2000/28 in the oxidation of 2-metyl-1,3-propandiols. To verify the real efficiency of the system, the experiment with other substrate will be carried out. Part 3: Hydroxylation of (R)-limonene into (R)-perillyl alcohol studied using recombinant whole cells harbouring an optimized redox gene operon (CYP153A6) which encodes a cytochrome P450, a ferredoxin, and a ferredoxin reductase from Mycobacterium sp. HXN-1500-

Questa tesi di Dottorato è stata strutturata in tre parti, una per ogni tipo di attività enzimatica trattata, preceduta da una breve introduzione riguardante i principi fondamentali della biocatalisi. Parte 1: Sono state studiate le caratteristiche strutturali e biochimiche dell’esterasi (BCE) prodotta per via ricombinante da Bacillus coagulans NCBI 9365. Questo enzima mostra un elevato grado di selettività nei confronti degli esteri (acetato, butirrato e benzoato) dell’1,2-O-isopropilidenglicerolo (IPG) un acetale equivalente chirale del glicerolo, che in entrambe le configurazioni, è un utile prodotto di partenza per la sintesi di molecole naturali biologicamente attive di interesse alimentare e farmaceutico come gliceridi, glicerofosfolipidi, -bloccanti ed antiipertensivi Parte 2: Sono state studiate le potenzialità biocatalitiche di batteri acetici, microrganismi noti per la loro capacità di accumulare prodotti di ossidazione (aldeidi, chetoni e acidi carbossilici) dati dalla trasformazione di alcoli primari e secondari. Questa parte risulta ulteriormente suddivisa in tre capitoli: • La desimmetrizzazione stereoselettiva di dioli achirali diversamente sostituiti, è stata eseguita ottenendo i corrispettivi acidi chirali utilizzando, cellule intere di Acetobacter aceti MIM 2000/28 • È stata studiata la sintesi chemo-enzimatica della forma enantiopura del captopril, noto farmaco utilizzato per il trattamento dell’ipertensione. Particolare attenzione è stata dedicata allo step enzimatico catalizzato da cellule immobilizzate di Acetobacter aceti MIM 2000/28 utilizzate in un sistema in continuo di “flow chemistry”. • La produttività e la stabilità del sistema di ossidazione “flow chemistry” è stato studiato e ottimizzata attraverso l’utilizzo del 2-metil 1,3 propandiolo. Per testare la reale efficienza del sistema in continuo messo a punto, sono in corso di studio le prove effettuate con ulteriori substrati. Parte 3: L'idrossilazione del (R) -limonene in (R)-alcool-perililico è stata studiata attraverso l’utilizzo di cellule intere ricombinanti di E. coli trasformate con l’operone sintetico ottimizzato che codifica per una citocromo P450 monossigenasi (CYP153A6), una ferredossina e una ferredossina reduttasi isolate dal ceppo Mycobacterium sp. HXN-1500