MOLECULAR BIOMARKERS OF WELFARE IN POULTRY

The thesis aims to explore the relationship between stress and immune response in poultry, focusing on acute phase proteins (APPs) and microRNAs (miRNAs) as welfare biomarkers for transport- and disease-related stress. We worked on two poultry species, namely turkey and chicken. Turkey (Meleagris gallopavo) was studied in order to provide new information in this species, which is poorly characterised for what concerns immunity and welfare. Existing studies related with avian species are mostly carried out on chicken (Gallus gallus), but there is still lacking information that needs to be addressed. In fact, we have complemented information, already available in chicken, describing the extrahepatic expression of APPs. The effects of transport-related stress on liver and adipose tissue gene expression of four APPs, namely α1-acid glycoprotein (AGP), Serum Amyloid A (SAA), PIT54 (Haptoglobin-like) and C-Reactive Protein (CRP) was investigated. The expression of AGP and CRP mRNA was found to be increased in liver and adipose tissue from birds after road transport. The presence of AGP protein was also confirmed. In addition, the expression of the same APPs was studied under a disease-related stress, caused by a heamorrhagic enteritis virus (HEV), which is a stressful disease for turkeys. As preliminary results, the expression of AGP, PIT54 and SAA mRNA was found to be increased in liver and adipose tissue from HEV-affected birds, while CRP expression was decreased in jejunum from HEV-infected birds. These results showed that road transport and HEV disease induce the mRNA expression of AGP, PIT54, SAA and CRP, suggesting their use as welfare biomarkers in turkey species. Although APPs are produced mainly by liver, extrahepatic production has been described in many species but not in poultry. The expression and location of five APPs, namely AGP, SAA, PIT54, CRP and OVT, was studied in 20 different tissues from healthy chickens. SAA, OVT and CRP mRNA expression was particularly higher in gastrointestinal tract, respiratory system and lymphatic system. AGP and OVT proteins were detected in different organs. Moreover, the expression of five miRNAs, namely miR-22, miR-155-5p, miR-181a-3p, miR-204 and miR-365-3p, was analyzed under transport-related stress in turkeys. The expression levels of miR-22, miR-155 and miR-365 were increased, suggesting they can be used to discriminate stressed- and unstressed animals. In order to better characterize the disease and to investigate a possible source of biomarkers, the intestinal proteome of turkeys was also determined to study the effects of HEV disease on intestinal mucosa. A total of 523 proteins were identified by SWATH-MS strategy between healthy and HEV-affected birds. A number of 64 of them were found to be differentially expressed. The effective presence of fifteen proteins related with immune system was also validated by mRNA expression. These findings can help us to better understand the effect of HEV in turkeys.

La tesi si propone di esplorare il rapporto tra stress e risposta immunitaria nel pollame, concentrandosi su proteine di fase acuta (APPs) e microRNA (miRNAs) come biomarcatori per il transporto e le malattie correlate a stress. Abbiamo lavorato su due specie di pollame, tacchino e pollo. Il tacchino (Meleagris gallopavo) è stato studiato in modo da fornire nuove informazioni in merito a questa specie, che è scarsamente caratterizza per quanto riguarda l'immunità e il benessere. Gli studi esistenti relativi alle specie aviarie sono stati effettuati sul pollo (Gallus gallus) e per completare le informazioni disponibili in letteratura, abbiamo descritto l'espressione extraepatica delle APPs in questa specie. Sono stati indagati gli effetti dello stress correlati al trasporto, studiando l’espressione genica di quattro APPs nel fegato e nel tessuto adiposo: α1-acid glycoprotein (AGP), Serum Amyloid A (SAA), PIT54 (Haptoglobin-like) and C-Reactive Protein (CRP). L'espressione di mRNA di AGP e CRP è risultata essere aumentata nel fegato e nel tessuto adiposo degli uccelli dopo il trasporto su strada. È stata confermata la presenza della proteina AGP. Inoltre, l'espressione delle stesse APPs è stata studiata anche nella patologia causata dal virus della enterite emorragica (HEV) e associata allo stress. Come risultati preliminari, l'espressione di mRNA di AGP, PIT54 e SAA era aumentata nel fegato e nel tessuto adiposo di uccelli HEV positivi; al contrario, l'espressione di CRP era ridotta nel digiuno di uccelli HEV-positivi. Questi risultati hanno dimostrato che il trasporto su strada e la malattia HEV inducono l'espressione di mRNA di AGP, PIT54, SAA e CRP, suggerendo il loro uso come biomarcatori del welfare nel tacchino. Sebbene le APPs siano prodotte principalmente dal fegato, la produzione extraepatica è stata descritta in molte specie, ma non nel pollame. L'espressione e la localizzazione delle cinque APPs (AGP, SAA, PIT54, CRP e OVT) è stata studiata in 20 diversi tessuti di polli sani. L’espressione di mRNA di SAA, OVT e CRP era particolarmente elevata nel tratto gastrointestinale, nelle vie respiratorie e nel sistema linfatico. Le proteine AGP e OVT sono state trovate in diversi organi. Inoltre, l'espressione di cinque miRNAs (miR-22, miR-155-5p, miR-181a-3p, miR-204 e miR-365-3p) è stata studiata nei tacchini in condizioni di stress legate al trasporto. Il livelli di espressione di miR-22, miR-155 e miR-365 erano aumentati, suggerendo il loro utilizzo per discriminare animali stressati e non stressati. Per caratterizzare meglio la malattia e individuare una possibile fonte di biomarcatori, è stato determinato anche il proteoma intestinale dei tacchini per studiare gli effetti della malattia HEV sulla mucosa intestinale. Sono state identificate 523 proteine utilizzando la strategia di SWATH-MS confrontando tacchini sani e malati e 64 proteine sono risultate essere differenzialmente espresse. È stata quindi validata l’espressione genica di quindici proteine correlate con il sistema immunitario. Questi risultati possono aiutare a comprendere meglio l'effetto di HEV nei tacchini.