INVESTIGATION ON THE BLUE PHENOTYPE IN PSEUDOMONAS SPECIES INVOLVED IN BLUE DISCOLORATION DEFECT OF FRESH CHEESE

In 2010 the occurrence of blue spots on Mozzarella cheese was reported from several consumers in Italy and highlighted by local and international media and by RASFF alert system (RASFF Annual Report 2010). P. fluorescens spp. was identified as the causing agent of this blue pigmentation. In this phD thesis work a collection of about 69 Pseudomonas spp. isolates (listed in Appendix 1) was used: from these 59 were isolated from spoiled samples of Mozzarella cheese presenting the blue coloration defect and identified by 16S rDNA sequencing. The production of the blue pigment was confirmed by incubation of the isolates in Mozzarella Preserving Fluid (PF) centrifuged and sterilized by filtration 0.22 µm; incubation was made at 4°C. The medium turned blue after 7 days in 30 samples (33.7% of the isolates). To investigate the genetic relationship between blue pigment-producing and blue pigment not-producing isolates, genome restriction was performed using SpeI enzyme, coupled with pulsed gel field electrophoresis (PFGE). From bands profile it was seen that the 30 blue producing isolates were grouped in 12 genotypes. From each genotype one representative strain was chosen for MultiLocus Sequence Typing analysis (MLST) to confirm a phylogenetic relationship among the blue pigment-producing strains. For 3 blue pigment-producing strains (200188/6, UMB247 and UMB248) the whole genome was sequenced and compared with 2 further blue pigment-producing strains genome (PS77 and PS20) and with the genomes of 5 blue pigment not-producing strains (PS40, PS20, Pf01, A506, SBW25). From this comparison a unique region of about 10kbp present in the blue pigment-producing strains and not shared by the blue pigment not-producing strains was found. This region is composed by 15 CDS, most of them (53.7%) coding for phage related elements. To investigate the relationship between the presence of prophages and the development of the blue phenotype the 30 blue pigment-producing isolates were induced by two different antibiotics (norfloxacin and ciprofloxacin). The presence of induced bacteriophages was assayed by measuring an inhibitory effect on the growing curves of blue pigment-producing Pseudomonas spp., by spot test assay and by plaques formation on double layer agar. For samples with a positive result from spot test, TEM photographs were made, showing two phage morphologies from a sample induced by ciprofloxacin. It was not possible to isolate these phages because they were not plaque producing. The other main topic of this job was the identification of the blue pigment and of its role in the ecology of P. fluorescens. To determinate the environmental requirement for its production several assays were made incubating the blue strains in PF at different temperature (4°C, 14°C and 30°C) and in M9 minimal medium at different pH (5.7, 6.3, 7.2) with (a) different carbon source (glucose, galactose, succinic acid, lactic acid), (b) different metals (Mo, Cu, Zn, Ca, Mg, Bo, Co, Mn, Fe) and (c) 18 different amino acids. From these phenotypic tests it resulted that the blue production occurred only at refrigeration temperature (lower than 14°C) in medium with pH 5.7. The presence of Cobalt or lysine inhibited the blue synthesis, while it was increased when proline was present. The individuation of the blue molecule/s from blue samples of PF and M9+proline incubated with strains 200188/6, UMB248 and UMB254 was made by UPLC/MS without leading to a definitive result. Trying to identify the function of the blue molecule/s, its possible connection with quorum sensing signals and its role as bacteriocine were investigated. Quorum sensing signals were found not to be related with blue production; as for the bacterial growth inhibiting effect it was noticed that the presence of the blue molecule/s, contrary of what expected, was able to promote the growing of Pseudomonas spp.

La presenza di macchie di colore blu su Mozzarella è una problematica attuale per le industrie produttrici di questa tipologia di formaggio fresco. In particolare dal 2010 sono stati segnalati diversi casi in Italia con grande risalto nei notiziari nazionali ed europei, causando anche una segnalazione da parte del sistema di allerta RASFF. La causa della formazione del colore blu è stata identificata nella contaminazione di ceppi appartenenti al genere Pseudomonas. Per questo lavoro di tesi di dottorato è stata costituita una collezione di 69 isolati appartenenti al genere Pseudomonas (elencati nel capito Appendix 1): di questi, 59 sono stati isolati da campioni di Mozzarella con difetto blu e identificati mediante sequenziamento della regione 16S rRNA. La produzione del pigmento blu è stata confermata incubando gli isolati nel liquido di governo di Mozzarella, precedentemente centrifugato e sterilizzato per filtrazione 0.22 µm (PF), a 4°C. Trenta campioni diventarono blu dopo 7 giorni (33.7% degli isolati). Su tutti gli 89 ceppi è stata fatta la restrizione del genoma usando l’enzima SpeI seguita dalla corsa elettroforetica in campo pulsato (PFGE) per valutare un’eventuale correlazione genetica tra gli isolati produttori del pigmento blu. Dai profili ottenuti i 30 isolati presentati il fenotipo blu sono stati raggruppati in 12 genotipi. Per ogni genotipo è stato scelto un ceppo rappresentativo su cui è stata fatta una tipizzazione attraverso il sequenziamento di 7 loci conservati (MultiLocus Sequence Typing) per confermare l’esistenza di una relazione filogenetica comune ai ceppi produttori del blu. Per 3 ceppi produttori del blu (200188/6, UMB247, UMB248) è stato sequenziato l’intero genoma. Le sequenze dei genomi ottenuti sono state confrontate con quelle di altri 2 ceppi produttori del blu (PS77 e PS22) e di 5 ceppi non presentanti la formazione del pigmento blu (PS40, PS20, Pf01, A506, SBW25). Da questa analisi di comparazione dei genomi è stata individuata una regione di circa 10 kbp presente unicamente nei genomi dei ceppi produttori del blu, composta da 13 CDS, la maggior parte delle quali (53.7%) codificante per proteine costitutive di batteriofagi. Per indagare la relazione tra la presenza di profagi integrati nel genoma dei ceppi produttori del blu e lo sviluppo di questo particolare fenotipo, i 30 isolati produttori del blu sono stati sottoposti a induzione con due diversi antibiotici (norfloxacina e ciprofloxacina). La presenza di batteriofagi indotti dal trattamento con gli antibiotici è stata verificata misurando un’eventuale attività inibente sulla crescita di ceppi produttori del blu di Pseudomonas spp., seguita dalla conferma mediante spot test e isolamento con la formazione di placche di lisi in doppio strato di agar. Alcuni campioni che hanno causato una zona di lisi negli spot test sono stati fotografati con microscopio elettronico a trasmissione. Attraverso le immagini sono state individuate due tipologie di particelle virali esclusivamente nei campioni indotti con ciporfloxacina. Non è stato però possibile procedere all’isolamento dei batteriofagi in quanto non sono state ottenute singole placche di lisi. L’altra tematica affrontata durante questo progetto di dottorato è stata l’identificazione della/e molecola/e blu e del suo ruolo nell’ambiente. Per determinare i requisiti necessari per la produzione del pigmento blu sono state allestite delle prove fenotipiche in liquido di governo a tre diverse temperature (4°C, 14°C e 30°C) e in terreno minimo M9 a diversi pH (5.7, 6.3, 7.2) addizionato con (a) differenti fonti di carbonio (lattosio, glucosio, galattosio, acido lattico e acido succinico), (b) diversi metalli (Mo, Cu, Zn, Ca, Mg, Bo, Co, Mn, Fe) e (c) 18 diversi amminoacidi. La produzione del pigmento blu è stata osservata solo quando i campioni sono stati incubati a temperature di refrigerazione (al di sotto dei 14°C) in liquido di governo o nel terreno minimo a pH 5.7. La presenza di Cobalto e di alcuni amminoacidi, ad esempio la lisina, hanno avuto un effetto inibente sulla produzione del pigmento blu, mentre l’aggiunta di prolina ne ha aumentato l’intensità. L’analisi UPLC/MS dei campioni 200188/6, UMB247 e UMB248 in liquido di governo e dei campioni in M9 + prolina non ha portato all’identificazione univoca della/e molecola/e che danno la colorazione blu. Per comprendere la funzione del pigmento blu sono state verificate una possibile correlazione con i segnali di quorum sensing e un possibile ruolo come batteriocina. I segnali di quorum sensing non sono risultati legati alla produzione del blu, mentre per quanto riguarda l’attività batteriostatica è risultato che, al contrario delle aspettative, il pigmento blu possiede un effetto positivo sulla crescita dei ceppi blu di Pseudomonas spp..